植物组织培养 刘军钟 10061900409 一尖验目的 熟悉植物组织培养技术,了解培养基的配置和灭菌,掌握无菌操作 掌握植物组织培养的操作过程及注意事项 了解植物组织培养的应用及前景 二尖验原理 植物组织培养广义的定义为:在无菌条件下,将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、 花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、 生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚、原生质体(如去壁后仍具有生活力的原生质体, 培养在人工配制的培养基上,给予适宜的培养条件,诱发产生愈伤组织,或潜伏芽等,或 经再分化等步骤成完整的植株 狭义的定义为:植物的任何器官、组织或细胞,在人工控制条件下,放在含有营养物质和 植物生长调节物质等组成的培养基中,使其生长、分化并形成完整植株的过程。根据外植 体来源和培养对象的不同,又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体 培养等。 其理论依据是植物细胞具有全能性,即植物体的每个细胞都携带着一套完整的基因组 并具有发育成完整植株的潜力。植物的组织在培养的条件下,原来已经分化停止生长的的 细胞,又能重新分裂,形成没有组织结构的细胞团,即愈伤组织,这一过程称为“脱分化 作用”。已经“脱分化”的愈伤组织在一定条件下,又能重新分化形成输导系统以及根和 芽等组织和器官,这一过程称为“再分化作用”。 植物激素在此过程中起着重要的作用,对某些植物而言,吲哚乙酸和6-苄基氨基腺嘌 呤的比例,决定了根和芽的分化。一般而言:①细胞分裂素与生长素共同使用,促进愈伤 组织的形成。②细胞分裂素>生长素时,有利于芽的发生。⑧细胞分裂素<生长素时,有 利于根的发生 组织培养的特点是:脱除病毒;取材少,培养材料经济;人为控制培养条件,不受自 然条件影响;生长周期短,繁殖率高;管理方便,利于自动化控制。组织培养不但是进行 细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段,而且在农学、园艺 林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。 以下为生产领域应用的概括: 培育新品种 胚培养 单倍体培养 试管受精 体细胞无性系的变异和筛选 原生质体培养和细胞杂交 基因工程育种 植物种质资源的保存和交换
植物组织培养 刘军钟 10061900409 一 实验目的 熟悉植物组织培养技术，了解培养基的配置和灭菌，掌握无菌操作 掌握植物组织培养的操作过程及注意事项 了解植物组织培养的应用及前景 二 实验原理 植物组织培养广义的定义为：在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、 花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、 生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体(如去壁后仍具有生活力的原生质体)， 培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织，或潜伏芽等，或 经再分化等步骤成完整的植株。 狭义的定义为：植物的任何器官、组织或细胞，在人工控制条件下，放在含有营养物质和 植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。根据外植 体来源和培养对象的不同，又分为植株培养、胚胎培养、器官培养、组织培养、原生质体 培养等。 其理论依据是植物细胞具有全能性，即植物体的每个细胞都携带着一套完整的基因组， 并具有发育成完整植株的潜力。植物的组织在培养的条件下，原来已经分化停止生长的的 细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化 作用”。已经“脱分化”的愈伤组织在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和 芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。 植物激素在此过程中起着重要的作用，对某些植物而言，吲哚乙酸和6-苄基氨基腺嘌 呤的比例，决定了根和芽的分化。一般而言：①细胞分裂素与生长素共同使用，促进愈伤 组织的形成。②细胞分裂素＞生长素时，有利于芽的发生。③细胞分裂素＜生长素时，有 利于根的发生。 组织培养的特点是：脱除病毒；取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自 然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。组织培养不但是进行 细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段，而且在农学、园艺、 林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。 以下为生产领域应用的概括： 培育新品种 – 胚培养 – 单倍体培养 – 试管受精 – 体细胞无性系的变异和筛选 – 原生质体培养和细胞杂交 – 基因工程育种 – 植物种质资源的保存和交换
次生代谢物质的生产 组织培养流程 分离外植体 脱分化 cotyledon 8 愈伤组织 植物体 幼茎、幼根 再分化 植株生长 三实验暴材和原料 实验器材: 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、循环水式真空泵、电子天平、P计、光照培养箱,搪瓷杯 搪瓷盘、100m1三角烧瓶(12个)、250m1三角瓶(2个)、试剂瓶、解剖刀柄与刀片、 单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移液管(1、2、5、10m1)、漏斗、量筒、烧杯〔50 100、500、1000m1),酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮 筋、脱脂棉、滤纸、pH试纸〔5.4-7.0)、标签纸、记号笔、称量纸、药勺等。 实验试剂: 次氯酸钠消毒液,75%的酒精,0.2%的升汞溶液 1N盐酸,1 n NaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖 05mg/m1的NA溶液:取25ng的NA,加入少量95%的酒精和1N的NaOH溶解, 再加蒸馏水定容至250m1 1ng/m1的6-BA溶液:取25mg的6-BA,用少量1N的盐酸溶解,再加蒸馏水 定容至250m1 实验材料:烟草叶
次生代谢物质的生产 三 实验器材和原料 实验器材： 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、循环水式真空泵、电子天平、PH 计、光照培养箱,搪瓷杯、 搪瓷盘、100 ml 三角烧瓶（12 个）、250 ml 三角瓶（2 个）、试剂瓶、解剖刀柄与刀片、 单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移液管（1、2、5、10ml）、漏斗、量筒、烧杯（50、 100、500、1000 m1），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮 筋、脱脂棉、滤纸、pH 试纸（5.4-7.0）、标签纸、记号笔、称量纸、药勺等。 实验试剂： 次氯酸钠消毒液, 75%的酒精 ,0.2％的升汞溶液. 1 N 盐酸,1 N NaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖. 0.5mg/ml 的NAA溶液：取25 mg 的 NAA，加入少量95%的酒精和1 N 的NaOH 溶解， 再加蒸馏水定容至250 ml。 1 mg/ml 的6-BA 溶液：取25 mg 的6-BA，用少量1 N 的盐酸溶解，再加蒸馏水 定容至250 ml。 实验材料： 烟草叶
实验步骤 )培养基的配制(MS+6-BA1mg/L+NA0.5mng/L 1、母液配制: MS培养基配方(mg/L) 1650 1900 大量元素(母液I) KH2PO4 170 20X MgS047H20 370 Cacl22H20 MnS04-4H20 22.3 ZnS04-7H20 8.6 微量元素(母液Ⅱ) H3B03 6.2 100X 0.83 NaMo042H20 CuS045H20 CoCl2-6H20 0.025 Fe盐(母液Ⅲ) FeS04 7H20 27.8 100X Na-EDTA 37.3 盐酸硫胺素VB1 0.4 有机物质(母液Ⅳ) 烟酸 VB5 0.5 100X 盐酸吡哆醇VB6 0.5 肌 100 30g/L 琼脂 8g/L 5.8 MS培养基含有近30种营养成分,为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进 行称量,可将培养基中的各种成分,按原量的几十倍分别称量,配成浓缩液,这种浓 缩液叫做培养基母液。这样每次使用时,取其总量的几十分之一,加蒸馏水稀释,制 成培养液。大量元素母液倍数略低,一般为10~20倍,微量元素和有机成分一般为 50~100倍。 按照上表中的配方分别配制大量元素(母液Ⅰ)、微量元素(母液Ⅱ)、Fe盐(母 液Ⅲ)、有机物质(母液Ⅳ)。每种母液分别按表中各组分的量依次加入,中间不断 搅拌,使其溶解完全,最后定容。各种母液配完后,分别用玻璃瓶贮存,并且贴上标 签,注明母液号、配制倍数、日期等,保存在冰箱的冷藏室中。 Fe盐(母液Ⅲ)的配制过程中应注意:将称好的FeSO47H2O和Na2EDTA2H2O 分别放到450mL蒸馏水中,边加热边不断搅拌使它们溶解,然后将两种溶液混合, 并将pH调至55,最后定容到1L,保存在棕色玻璃瓶中。 2、植物激素配制: 称取10 mg NAA,加入少量酒精,并加水定容50m(浓度为02mgm),称取50 mg6-BA,加少量的1 molL Hcl,使其充分溶解,然后加水至50m(浓度为1mg/m)
四、实验步骤 （一） 培养基的配制(MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L) 1、母液配制： MS培养基配方（mg/L ） NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 MgSO4·7H2O 370 大量元素（母液Ⅰ） 20 X CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 ZnSO4·7H2O 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 NaMoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 微量元素（母液Ⅱ） 100 X CoCl2·6H2O 0.025 Fe盐（母液Ⅲ） FeSO4·7H2O 27.8 100 X Na-EDTA 37.3 盐酸硫胺素VB1 0.4 烟酸 VB5 0.5 盐酸吡哆醇VB6 0.5 有机物质（母液Ⅳ） 100 X 肌醇 100 蔗糖 30g/L 琼脂 8g/L pH 5.8 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进 行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的几十倍分别称量，配成浓缩液，这种浓 缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的几十分之一，加蒸馏水稀释，制 成培养液。大量元素母液倍数略低，一般为10～20倍，微量元素和有机成分一般为 50～100倍。 按照上表中的配方分别配制大量元素（母液Ⅰ）、微量元素（母液Ⅱ）、Fe 盐（母 液Ⅲ）、有机物质（母液Ⅳ）。每种母液分别按表中各组分的量依次加入，中间不断 搅拌，使其溶解完全，最后定容。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标 签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。 Fe 盐（母液Ⅲ）的配制过程中应注意：将称好的 FeSO4·7H2O 和 Na2-EDTA·2H2O 分别放到 450 mL 蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合， 并将 pH 调至 5.5，最后定容到 1 L，保存在棕色玻璃瓶中。 2、植物激素配制： 称取10 mg NAA,加入少量酒精，并加水定容50 ml (浓度为0.2 mg/ml),称取 50 mg 6-BA, 加少量的1 mol/L HCl，使其充分溶解，然后加水至50 ml (浓度为1 mg/ml)
3、MS基本培养基的配制 分别吸取MS贮备液150m(大量元素)、3.0m微量元素、3.0ml铁盐、30ml 有机,加入1L的玻璃杯中,然后称取蔗糖90g,加入约150ml蒸馏水,搅拌使蔗糖溶 解,然后定容到300ml。将培养基分装入六个锥形瓶中(每瓶中已放入4g琼脂),每 瓶50ml培养基,贴好标签,其中三瓶按下表中“1”的激素比例加入激素,另外三瓶 按“2”加入激素,搅拌均匀后,用10%的NaOH溶液调节PH至5.8.盖上封口膜, 用牛皮纸包扎。 激素比: NAA 6-BA 比例 0.5mg/m1 1O.1mg/m. 1mg/ml (二)培养基灭菌 压力上升到04 公斤/平方厘米 加水 装料 加盖 排气 取出物 品烘王 降压 保压 升压 节火焰 105公斤/平方 保温20分钅 厘米 PS:接种操作所需的一切用具,如长镊子、解剖刀、剪刀、培养皿(内放4-6张滤纸)等,也 用报纸包好,注明组别;用1L的大锥形瓶装入约500m1的灭菌水(2瓶),扎好口,同时灭菌 灭菌结束后,用报纸包着的物品务必烘干 (三)诱导产生愈伤组织 接入外植体: ◆取健壮的烟草叶片一至两片,流水冲洗干净,草纸擦干,备用 在无菌操作台上,裁剪成0.5×0.5cm叶片,放于70%乙醇中处理30秒,无菌水洗冫 再放到0.1%升汞溶液中5分钟,无菌水冲洗4-5遍,每次3分钟,用滤纸吸干。 在近酒精灯火焰旁用长镊子将它们接种在诱导培养基上,注意使叶片按自然生长时 的状态放入。每瓶接种2-3片,接种后扎好瓶口。 温箱中培养:
3、MS 基本培养基的配制： 分别吸取MS 贮备液15.0 ml（大量元素）、3.0 ml 微量元素、3.0 ml 铁盐、 3.0 ml 有机, 加入1 L 的玻璃杯中，然后称取蔗糖9.0g, 加入约150ml蒸馏水，搅拌使蔗糖溶 解，然后定容到300ml。将培养基分装入六个锥形瓶中（每瓶中已放入4g琼脂），每 瓶50ml培养基，贴好标签，其中三瓶按下表中“1”的激素比例加入激素，另外三瓶 按“2”加入激素，搅拌均匀后，用10%的NaOH溶液调节PH至5.8.盖上封口膜，并 用牛皮纸包扎。 激素比： NAA 6-BA 比例 1 0.5mg/ml 0.1mg/ml 5：1 2 0.1mg/ml 1mg/ml 1：10 (二)培养基灭菌 PS: 接种操作所需的一切用具,如长镊子、解剖刀、剪刀、培养皿（内放4-6张滤纸）等,也 用报纸包好，注明组别；用1L的大锥形瓶装入约500ml的灭菌水（2瓶），扎好口，同时灭菌。 灭菌结束后，用报纸包着的物品务必烘干。 （三）诱导产生愈伤组织 接入外植体： 取健壮的烟草叶片一至两片，流水冲洗干净，草纸擦干，备用。 在无菌操作台上，裁剪成0.5×0.5cm叶片，放于70%乙醇中处理30秒，无菌水洗净 再放到0.1% 升汞溶液中5分钟，无菌水冲洗4—5遍，每次3分钟，用滤纸吸干。 在近酒精灯火焰旁用长镊子将它们接种在诱导培养基上，注意使叶片按自然生长时 的状态放入。每瓶接种2-3片，接种后扎好瓶口。 温箱中培养：
亠将已植入植物组织(外植体)的三角烧瓶培养在25℃温箱中,每星期检査1-2次 将材料已被杂菌污染的三角烧瓶剔除 3-4周后将产生愈伤组织。而后长出根和芽,成为小苗 选取小苗生长良好的三角烧瓶,用解剖刀将愈伤组织切下,转移到生根培养基中 每瓶放1-2株小苗,仍培养在25℃温室中,每周1-2次观察。 小苗1-2周可以迅速长大,当长出根和叶时,打开瓶口,令其适应外界环境,然 后移栽到花盆中培养。 注意事项: 1.配制培养基时,一定要注意调节pH(5.8-6.0)。PH过高则培养基较硬,不适于植物生长 PH过低则培养基不能凝固,不能为植物生长提供良好环境 2.外植体不能太小或太大,否则会影响愈伤组织的形成 3.配制贮存母液时,要算好各种成分逐次加入,等第一种成分完全溶解后再加入第二种成 分;配置过程中,有些物质要单独配制,比如螯合物,要在高温条件下配置:试剂的添 加顺序可能会导致沉淀的产生 4.实验所使用的器材要严格灭菌,注意无菌操作,避免因染菌导致实验失败;无菌操作时 切割叶片等时近火操作;手及手臂,衣服避免到达培养皿上空 5.消毒时,注意时间,避免太长时间导致组织受到破坏,特别是在升汞中;切割叶片及转 移接种时,对叶片的损伤越少越好。 五尖验记录: 1、10月9日配制诱导愈伤组织的培养基并高压天菌,第三天收到通 知说培养基没有凝固,于是10月11日又去配了一次,并高压天菌。但 令人气恼的是,10月16日去肘培养基还是没凝固,配了第三次培养基, 这次终于凝固了。前两次没凝固,分析原因是PH未调好,因为我们 是根据别人经验值加的碱液,最后一次我们用PH试纸准确的调PH, 成功了。 2、10月23号,在超净工作台上接入外植体(烟草叶片),封好瓶 口置光照培养箱培养。但三号组叶片全部姜蔫死亡。我们重新配了培 养基,接种叶片。 周多后,即11月4号,叶片稍有变化,有的形成愈伤组织。 左边有片叶子枯萎了,但上面还有点“绿色”,星星之火,可以燎 原。右边开始形成愈伤组织
将已植入植物组织（外植体）的三角烧瓶培养在25℃温箱中，每星期检查1-2 次， 将材料已被杂菌污染的三角烧瓶剔除。 3-4 周后将产生愈伤组织。而后长出根和芽，成为小苗。 选取小苗生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到生根培养基中， 每瓶放1-2 株小苗，仍培养在25℃温室中，每周1-2 次观察。 小苗1-2 周可以迅速长大，当长出根和叶时，打开瓶口，令其适应外界环境，然 后移栽到花盆中培养。 注意事项： 1．配制培养基时，一定要注意调节pH（5.8-6.0）。PH过高则培养基较硬，不适于植物生长； PH过低则培养基不能凝固，不能为植物生长提供良好环境。 2. 外植体不能太小或太大，否则会影响愈伤组织的形成。 3. 配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成 分；配置过程中，有些物质要单独配制，比如螯合物，要在高温条件下配置；试剂的添 加顺序可能会导致沉淀的产生； 4. 实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；无菌操作时 切割叶片等时近火操作；手及手臂，衣服避免到达培养皿上空。 5．消毒时，注意时间，避免太长时间导致组织受到破坏，特别是在升汞中；切割叶片及转 移接种时，对叶片的损伤越少越好。 五 实验记录： 1、 10月9日配制诱导愈伤组织的培养基并高压灭菌，第二天收到通 知说培养基没有凝固，于是10月11日又去配了一次，并高压灭菌。但 令人气恼的是，10月16日去时培养基还是没凝固，配了第三次培养基， 这次终于凝固了。前两次没凝固，分析原因是PH未调好，因为我们 是根据别人经验值加的碱液，最后一次我们用PH试纸准确的调PH， 成功了。 2、 10月23号，在超净工作台上接入外植体（烟草叶片），封好瓶 口置光照培养箱培养。但二号组叶片全部萎蔫死亡。我们重新配了培 养基，接种叶片。 3 、一周多后，即 11 月 4 号，叶片稍有变化，有的形成愈伤组织。 左边有片叶子枯萎了，但上面还有点“绿色”，星星之火，可以燎 原。右边开始形成愈伤组织