2.碱变性法： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。 在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
2.碱变性法： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。 在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA 会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变 性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性 染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅 速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
3.碱变性法： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的 液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg 溶菌酶）静置5分钟； 3、加入200微升微冷的 液（0.2NaOH， 1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。 4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡 后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收 集质粒DNA
3.碱变性法： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的 液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4~5mg 溶菌酶）静置5分钟； 3、加入200微升微冷的 液（0.2NaOH， 1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用。 4、加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡 后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收 集质粒DNA
4.影响质粒DNA产量的因素： 1、寄主菌株的遗传背景 使用endA基因发生突变的菌株，编码核酸内 切酶 从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施： 选择最适的培养条件，以限制在细胞 生长期间，体内核酸内切酶 的表达； 在纯化质粒DNA的过程中，用加热法 核酸内切酶 使失活； 采用最佳的实验流程，减少核酸内切 酶 的污染并在纯化了质粒DNA之后，迅速除 去污染的核酸酶
4.影响质粒DNA产量的因素： 1、寄主菌株的遗传背景 使用endA基因发生突变的菌株，编码核酸内 切酶 从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施： 选择最适的培养条件，以限制在细胞 生长期间，体内核酸内切酶 的表达； 在纯化质粒DNA的过程中，用加热法 核酸内切酶 使失活； 采用最佳的实验流程，减少核酸内切 酶 的污染并在纯化了质粒DNA之后，迅速除 去污染的核酸酶
2、质粒的拷贝数及分子的大小 插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷 贝数的下降
2、质粒的拷贝数及分子的大小 插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷 贝数的下降
（三）、质粒载体的构建与类型 1. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的 天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等， 但存在一定的局限性
（三）、质粒载体的构建与类型 1. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的 天然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等， 但存在一定的局限性