调亡小体吞噬细胞BAMild convolutionNuclearfragmentationChromatinApoptoticPhagocyticcompactionandBlebbingbodysegregationcellCell fragmentationCondensationofcytoplasmPhagocytosis(a)
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(Morphological features during the programmedcell death)((1)Initiation: the disappearance of the cell surface structure such as microvilli, the loss of cellcontaction, the mild convolution of the ER with plasm, the cytoskeleton collapse, thedisassembles of the nuclear envelope and chromatin compaction and segregation,(2)Formationof theapoptoticbodies:nuclear chromatinbreak up intofragments,thecell surfaceblebs and the cell breaks up intomembrane-enclosed fragments called apoptoticbodies,(3)Engulf:owingtothe loss of contaction withtheneighboringcell,theapoptoticbodieswillquickly be engulfed by neighboringcell ormacrophages beforetheir content to be spilled out)The typical feature of the programmed cell death:The neat death without content spilling, Nodamaging inflammatory response; ATP-depending cell self-killing,3.细胞调亡的生化特征1细胞凋亡的主要特征是形成大小为180～200bp特征性的DNAladders一发生核小体间断裂。2凋亡细胞tTG（组织转谷氨酰胺酶tissueTransglutaminase）积累并达到较高水平。tTG催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持调亡小体的完整性，防止有害物质渗漏。一tTG活性依赖于Ca2十，生活细胞内Ca2十浓度低，故其活性低：调亡起始时，Ca2十浓度上升，从而活性升高。一tTG催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持调亡小体的完整性，防止有害物质渗漏。（二）细胞调亡的检测1.形态学观测（morphologicalobservance）：（1)染色法：（staining）台盼蓝（trypanblue）：活细胞排斥，但可使死细胞着色；DAP1：是常用的一种与DNA结合的荧光染料，用DAP1染色借助荧光显微镜，可以观察到细胞核的形态变化；姬姆萨（Giemsa）：可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、凋亡小体的形成等调亡过程。透射和扫描电镜观察：可观察调亡细胞的形态、结构变化，如染色质固缩、调亡小体的形成、细胞发泡等现象。6
6 (Morphological features during the programmed cell death) (⑴Initiation: the disappearance of the cell surface structure such as microvilli, the loss of cell contaction, the mild convolution of the ER with plasm, the cytoskeleton collapse, the disassembles of the nuclear envelope and chromatin compaction and segregation; ⑵Formation of the apoptotic bodies: nuclear chromatin break up into fragments, the cell surface blebs and the cell breaks up into membrane-enclosed fragments called apoptotic bodies; ⑶Engulf:owing to the loss of contaction with the neighboring cell, the apoptotic bodies will quickly be engulfed by neighboring cell or macrophages before their content to be spilled out) The typical feature of the programmed cell death: The neat death without content spilling; No damaging inflammatory response; ATP-depending cell self-killing; 3. 细胞凋亡的生化特征 1 细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180～200bp 特征性的 DNA ladders—发生核小体间 断裂。 2 凋亡细胞 tTG（组织转谷氨酰胺酶 tissue Transglutaminase）积累并达到较高水平。tTG 催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持凋亡小体的完整性，防止有害物质滲漏。 －tTG 活性依赖于 Ca2＋，生活细胞内 Ca2＋浓度低，故其活性低；凋亡起始时， Ca2＋ 浓度上升，从而活性升高。 －tTG 催化细胞内蛋白质交联，聚合，有助于保持凋亡小体的完整性，防止有害物质滲漏。 （二）细胞凋亡的检测 1.形态学观测（morphological observance）： ⑴染色法:（staining） 台盼蓝（trypan blue）:活细胞排斥，但可使死细胞着色； DAP1：是常用的一种与 DNA 结合的荧光染料，用 DAP1 染色借助荧光显微镜，可以观察 到细胞核的形态变化； 姬姆萨（Giemsa）：可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、凋 亡小体的形成等凋亡过程。 透射和扫描电镜观察：可观察凋亡细胞的形态、结构变化，如染色质固缩、凋亡小体的形 成、细胞发泡等现象
A,NormalcellB.Apoptosis:Apoptoticbodies（正常和调亡的T细胞杂交瘤细胞的扫描电镜照片）DAP1染色显示调亡细胞的染色质凝集B■A：正常细胞核B：调亡细胞核(2)DNA电泳(DNAelectrophoresis)：DNA片段就呈现出梯状条带即调亡细胞的DNA由于在核小体间发生断裂，产生200bp及其整倍数的片段，经琼脂糖凝胶电泳呈现出的梯状条带
7 (正常和凋亡的 T 细胞杂交瘤细胞的扫描电镜照片) ⑵DNA 电泳(DNA electrophoresis)：DNA 片段就呈现出梯状条带 即凋亡细胞的 DNA 由于在核小体间发生断裂，产生 200bp 及其整倍数的片段， 经琼脂糖凝胶电泳呈现出的梯状条带
细胞色素c诱的凋亡细胞DNA电泳图1.细胞色素c诱导0广款用h招明范在-2kb格小体所2.细胞色素c诱导1h-1kb3.细胞色素c诱导2h500bp细胞色素c诱导34h-200bp细胞色素c诱导45.h6.阴性对鼠7.Marker(180~200bpDNAladder,Accumulationof tTG,PSflip-flop;180~200bpDNAladderAccumulationoftTG,PSflip-flop;ApoptosisinducedbyCytoC;Lane1. 0h; 2. 1h; 3.2h; 4.3h; 5.4h; 6.Control; 7.Marker)(Endonuclease cleaves the chromosomal DNA into fragments of distinctive size; becausethe cleavages occur in the linker regions between nucleosomes, the fragments separate intoa characteristic ladder pattern when analyzed bygel eletrophoresis)(0,1,3,6,12小时)（3)TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法针对DNA分子中断裂缺口中的3OH进行原位标记，凋亡细胞的核DNA中产生的3OH末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。8
8 （180~200bp DNA ladder, Accumulation of tTG, PS flip-flop；180~200bp DNA ladder, Accumulation of tTG, PS flip-flop；Apoptosis induced by Cyto C； Lane 1．0 h；2．1 h；3．2 h；4．3 h；5．4 h；6．Control；7．Marker） （Endonuclease cleaves the chromosomal DNA into fragments of distinctive size; because the cleavages occur in the linker regions between nucleosomes, the fragments separate into a characteristic ladder pattern when analyzed by gel eletrophoresis） (0,1,3,6,12 小时) ⑶TUNEL 测定法，即 DNA 断裂的原位末端标记法 针对 DNA 分子中断裂缺口中的 3’OH 进行原位标记，凋亡细胞的核 DNA 中产生的 3’ OH 末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察
248a-16sCon16s左：正常16体节期的斑马鱼胚胎在发育过程中有少量细胞发生调亡；右：突变体的中枢神经细胞发生大量调亡（图为鸡的组织在某一发育过程中发生凋亡：原理：针对DNA分子中断裂缺口中的3'OH进行原位标记，凋亡细胞的核DNA中产生的3'OH末端，可帮助荧光素进行原位标记，并用荧光显微镜进行观察。）(4)彗星电泳法（cometassay）原理是将单个细胞最浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电泳，并用荧光染料染色，调亡细胞中的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈现一种彗星式的图案，而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快速简便的凋亡检测法。(5)流式细胞分析：与正常完整的二倍体细胞相比，调亡细胞DNA发生断裂和丢失，呈亚二倍体状态；采用9
9 （图为鸡的组织在某一发育过程中发生凋亡；原理：针对 DNA 分子中断裂缺口中的 3’OH 进行原位标记，凋亡细胞的核 DNA 中产生的 3’OH 末端，可帮助荧光素进行原位标记， 并用荧光显微镜进行观察。） ⑷彗星电泳法（comet assay） 原理是将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中，经裂解处理后，再在电场中进行短时间的电 泳，并用荧光染料染色，凋亡细胞中的 DNA 降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞 核呈现一种彗星式的图案，而正常的无 DNA 断裂的核在泳动时保持圆球形，这是一种快 速简便的凋亡检测法。 ⑸流式细胞分析： 与正常完整的二倍体细胞相比，凋亡细胞 DNA 发生断裂和丢失，呈亚二倍体状态；采用