细胞内总DNA的提取和基因文库的构建 各种生物的特定组织(如血液、肝脏、植物组织、细菌细胞等) 都含有大分子量的DNA。由于目的基因位于整个基因组DNA中, 难以检出和分离,可以先将基因组DNA用内切酶切成较小的片段 ,再将它们分别与载体相连,并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增 ,再对各个不同的克隆作出检定。 非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机DNA片段的过程称 鸟枪法,全部克隆集合体称某一生物的基因文库。组成一个生物 的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了 个生物的整个基因组
细胞内总DNA的提取和基因文库的构建 各种生物的特定组织（如血液、肝脏、植物组织、细菌细胞等） 都含有大分子量的DNA。由于目的基因位于整个基因组DNA中， 难以检出和分离，可以先将基因组DNA用内切酶切成较小的片段 ，再将它们分别与载体相连，并转入细菌细胞中进行繁殖和扩增 ，再对各个不同的克隆作出检定。 非选择性地在细菌细胞中克隆某一生物的随机DNA片段的过程称 鸟枪法，全部克隆集合体称某一生物的基因文库。组成一个生物 的基因文库的全部重组质粒或重组噬菌体中的目的基因就代表了 一个生物的整个基因组
G-A-A-T-T-C G-A-A-T-T-C T-A-A-G Cleavage with ECoRI Cleavage with ECoRI A-A-T-T-C Fragments with T-T-A-A complementary tails p Annealing allows recombinant GA-A-T-T-C DNA molecules to form by complementary base pairing C-T-T-A-AIG The two strands are not covalent bonded as indicated by shaded gaps Gap DNA ligase g-AA-TT-CTTT DNA ligase seals the gaps valently bonding the C-T-T-A-A two strands 直接产生粘性末端用于组成一个新的重组 DNA分子( recombinant dna)16-2
一、直接产生粘性末端用于组成一个新的重组 DNA分子（recombinant DNA） 16-2
二、加尾连接( Tailing) 同聚物加尾 末端转移酶( terminal transferase)能催化DNA的3末端加上 核苷酸尾,如将dA和dT加到不同的DNA末端,就可以连接成重组 质粒, poly和poyC也可用相同方法加尾。 同聚物加尾连接的优点:加尾后DNA片段自身不会环化, 可提高异源DNA重组率。缺点:加入的 polyA和 polyT可能影响基 因表达;外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切 出来
二、加尾连接（Tailing） 1．同聚物加尾 • 末端转移酶（terminal transferase）能催化DNA的3’末端加上 核苷酸尾，如将dA和dT加到不同的DNA末端，就可以连接成重组 质粒，polyG和polyC也可用相同方法加尾。 • 同聚物加尾连接的优点：加尾后DNA片段自身不会环化， 可提高异源DNA重组率。缺点：加入的polyA和polyT可能影响基 因表达；外源基因克隆扩增后不能用限制酶重新从重组质粒中切 出来
Drosophila dna Plasmid DNA ear E CORI AATT 外切酶 TTAA . 外切酶 末端转移酶 dATP dTTP 末端转移酶 AAA TTTT 3 AAAA TTTTT AAA 末端转移酶( TT TT termina AAAA transferase)能 催化DNA的3 TT TTT 末端加上核苷 DNa polymerase DNa ligase AAAA 酸尾,如将dA 和dT加到不同 TT TT 的DNA末端, AAAAA 就可以连接成 重组质粒 T TTTT
TTAA AATT 5 , 3 , 3 , 5 , 5 , 3 , 3 , 5 , AAA AAAA 5 , 3 , 5 , 3 , AAA AAAA TT TTT TT TT AAAA AAAAA T TT TT TT TT 5 , 3 , 3 , 5 , 5 , 3 , 3 , 5 , 5 , 3 , 5 , 3 , E coRI 外切酶 末端转移酶 dATP shear 外切酶 dTTP 末端转移酶 TTTT TTTTT Plasmid DNA Drosophila DNA DNA polymerase,DNA ligase 末端转移酶（ terminal transferase）能 催化DNA的3’ 末端加上核苷 酸尾，如将dA 和dT加到不同 的DNA末端， 就可以连接成 重组质粒
2.人工接头的应用 人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段 ECoRI CCGAATTCGG ECORI GGCTTAAGCC 人工接头 ECoRI
2．人工接头的应用 人工接头是一个合成的含有特定限制酶识别顺序的核苷酸片段 。 EcoRI ↓ C C G AA T T C G G EcoRI G G C T T A A G C C 人工接头 ↑ EcoRI