2017/9/12 光学显微图象处理技术 染色体 二、电子显微镜技术（最小分辨率0.2nm) (一)、透射电子显微镜 ·学系统由明系统特品室、成像系统 观察窗和记录用的照 相装置等组成 真空系统由机械泵和真空泵组成： 电子学系统由供电系统和高压稳压系统 ·成象原理： 以电子束作光源，电磁场作透镜。真空下阴极 阳椒 聚光镜 初放大，中间镜和投影镜的进一步放大，产生了电镜 下最终图像。 11
2017/9/12 11 光学显微图象处理技术 计算机辅助解析图象—图象解卷积 (A) 果蝇多线染色体荧光显微图, (B) 图象解卷积后 多线染色体上的袢环带（0.25μm）清晰可见，达到 光学显微镜分辨率极限. (John Sedat Laboratory.) 21 光学显微三维重构技术—3D structured illumination microscopy：小鼠 C2C12分裂前期细胞核三维投影图 （3D-SIM技术,分辨率可达0.2μm）. 染色体 (红) 被核 纤层 (绿)包围。 Lothar Schermelleh, Peter Carlton. http://medicalphysicsweb.org 细胞核多光子显微术3-D 重建（Multiphoton microscopy 3-D reconstruction ）： HSF (热休克蛋白转录因子， 绿色) 及DNA (红色) 定 位在热冲击后的活性多 线染色体构成的细胞核 中。 二、电子显微镜技术（最小分辨率0.2nm) （一）、透射电子显微镜 透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM) 透射电子显微镜主要是让电子束穿透样品而成像。 结构组成： 电子光学系统(镜筒) 由照明系统、样品室、成像系统、观察窗和记录用的照 相装置等组成； 真空系统由机械泵和真空泵组成； 电子学系统由供电系统和高压稳压系统。 成象原理： 以电子束作光源 电磁场作透镜 真空下阴极 22 ， 。真空下阴极 发射电子，栅极挤压成束，阳极加速，聚光镜会聚成 极细的快速电子照射在样品上；由于电子透过样品的 亮，而透不过的暗于是形成黑白图像；该图像经物镜 初放大，中间镜和投影镜的进一步放大，产生了电镜 下最终图像
2017/9/12 超薄切片下TEM拍摄图实例： 线教体TE围 核型多角体病毒感染家蚕细胞TE训图（张敏州提供） (二)扫描电子显微镜(SEM)一用来观察标本的表面结构。 ·扫特魏镜得是年发程的生物个于电匙学显微镜之间的 安种装洛器一 通过电子束与样品的相互作用产 动大梅 一电子 器 12
2017/9/12 12 超薄切片下TEM拍摄图实例： 线粒体TEM图 核型多角体病毒感染家蚕细胞TEM图（张敏娟提供） 23 TEM下观察到的杆状病毒粒子。（a和b）病毒感染的细胞上清收集之后超速离心（10，000 g×1 h），收集到的 BV病毒粒子用超纯水重悬，2%磷酸钨（PTA）负染之后电镜观察。（c）病毒感染的细胞超薄切片后正染的图片， 杆状病毒子包装在核衣壳内并被囊膜包被。 （二）扫描电子显微镜(SEM)——用来观察标本的表面结构。 扫描电镜（SEM）是1965年发明的细胞生物学研究工具，是介于透射电镜和光学显微镜之间的 一种微观形貌观察手段，可直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像。 原理：主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄 的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中 主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形貌像， 这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得 放大像。 SEM优点：①有较高的放大倍数，20-20万倍之间连续可调；②有很大的景 深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微 结构；③试样制备简单。 24 扫描电镜原理示意图（A），扫描电镜下 可清晰地显示原生动物四膜虫表面的纤毛 和口器（B)
2017/9/12 右国男人活 水稻叶片及谷粒用体视显徽镜及扫描电镜观察图像（李文强提供）， 13
2017/9/12 13 右图：结核杆菌侵入肺部被肺绒毛细胞吸 附。http://www.einstein.yu.edu 25 血细胞扫描电镜图。http://users.edinboro.edu 植物花粉扫描电镜图http://www.answers.com 26 • 水稻叶片及谷粒用体视显微镜及扫描电镜观察图像（李文强提供）
2017/9/12 (三)电镜制样技术 1电镜制样技术-超薄切片技术 透射电镜样品的制备如同光学显微镜，样品也需固定、脱水 港透、包埋、切片、捞片、染色等。 扫描电镜样品的制备包括固定、脱水、干燥、粘样、喷涂 常-s-1-回 -①- 2.负染色技术(negative stainning) 负染是利用某些高电子密度的重金属盐包围样品，以便在电子致密的 深背景下反衬出低电子致密样品结构。 操作过程：首先是将被观察的样品吸附在具有膜的铜网上，接着进行 染色。 应用： 酸和以通过负染色电技术观共精 结构，还可以从不同角 ·负染技术：用重金属盐（如 染料 14
2017/9/12 14 1 电镜制样技术-超薄切片技术 透射电镜样品的制备如同光学显微镜，样品也需固定、脱水、 （三） 电镜制样技术 渗透、包埋、切片、捞片、染色等。 扫描电镜样品的制备包括固定、脱水、干燥、粘样、喷涂。 2. 负染色技术 (negative stainning) 负染是利用某些高电子密度的重金属盐包围样品，以便在电子致密的 深背景下反衬出低电子致密样品结构。 操作过程：首先是将被观察的样品吸附在具有膜的铜网上， 接着进行 染色。 负染特点：操作简单，快速方便，分辨率高，样品用量少等优点。 应用：一些生物大分子和小颗粒结构,如病毒、细菌、线粒体、核糖体、 核酸和蛋白等可以通过负染色电镜技术观察其精细结构，还可以从不同角 度观察三维结构。 • 负染技术：用重金属盐（如 磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺 展在载 的样 进行染色 在载网上的样品进行染色； 吸去染料，待样品干燥后， 样品凹陷处就铺上了一薄层 重金属盐，而凸的出地方则 没有染料沉积，从而出现负 染效果。分辨力可达1.5nm 左右