2017/9/12 第三章细胞生物学的研究方法 样品准备 图像分析 显微镜拍 定量和统计分析 本章概要 1,显微镜技术； 2.X射线衍射技术； 3.流式显微荧光技术 4放射自显影技术 5.蛋白质亚细胞定位技术；6.双分子互作重速技术： 7.荧光共振能量转移技术；8.原位杂交技术； 9.分子细胞生物学方法： 10.细胞培养和细胞杂交技术 11.基因转移技术。 学习重点： 1、業握各种显徽镜术的原理及适用范围。 2、了解各种分子细胞学方法和基因转移技术。 1
2017/9/12 1 第三章 细胞生物学的研究方法 1 西北农林科技大学生命科学学院-细胞生物学教研室 本章概要： 1.显微镜技术； 2.X射线衍射技术； 3.流式显微荧光技术； 4.放射自显影技术； 5.蛋白质亚细胞定位技术； 6.双分子互作重建技术； 7.荧光共振能量转移技术； 8.原位杂交技术； 9.分子细胞生物学方法； 10.细胞培养和细胞杂交技术； 11.基因转移技术。 学习重点： 1、掌握各种显微镜术的原理及适用范围。 2、了解各种分子细胞学方法和基因转移技术
2017/9/12 第一节细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 几种显微镜可观察的样品大小 (箭头之间的范围)及其分辨 能力（右侧箭头所指位置 1 cm 1 mm 100 um 10 um 1 um 100 om 10 nm 1 nm 0.1 nm ,光学显微镜 —电子显领轴 —扫能道显镜一—— ·分辨率：能区分开两个质点间的最小距离 ‘0m镜和电子显薇镜的分辨率分别为：02mm 2
2017/9/12 2 第一节 细胞形态结构的观察方法 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜 3 几种显微镜可观察的样品大小 （箭头之间的范围）及其分辨 能力（右侧箭头所指位置 4 • 分辨率：能区分开两个质点间的最小距离 • 眼睛、光学显微镜和电子显微镜的分辨率分别为：0.2mm、 0.2μm和0.2nm
2017/9/12 一、光学显微镜 (一)、普通复式光学显微镜 (二)、相差显微镜和微分干涉显微镜 (三)、荧光显微镜 (四)、激光扫描共焦显微镜 普通光学显数铺 光共聚焦扫描显微 CH30CX40生物相差登镜 3 3
2017/9/12 3 一、光学显微镜 （一）、普通复式光学显微镜 （二）、相差显微镜和微分干涉显微镜 （三）、荧光显微镜 （四）、激光扫描共焦显微镜 5 普通光学显微镜 荧光显微镜 荧光显微镜 激光共聚焦扫描显微镜 6
2017/9/12 通光学成示童国 决定光学显微镜的分辨率的要素： 显微镜的分辨率：显徽镜的分辨率就是显微镜能看到的最小的东西， 公舞率的大钠被熊的处裤力来决定的：物镜的分辨力又是由它的数值孔 可人淀分所 晋是光学被核德明夜9m军720而瓷中的数值孔径大小最高等于1。 D 0.61 N.sin(a/2) yD:分辨率 入：入射光的波长 所介质的折射率(1或1.5) √ā：物镜的镜口角
2017/9/12 4 （一）、普通（复式）光学显微镜 • 结构：1）光学放大系统。2）照明系统。3）机械和支架系统。 普通光学显微镜成像示意图 7 决定光学显微镜的分辨率的要素： • 显微镜的分辨率：显微镜的分辨率就是显微镜能看到的最小的东西。 • 分辨率的大小由物镜的分辨力来决定的；物镜的分辨力又是由它的数值孔 径和照明光线的波长决定的. • 不同的显微镜的分辨率有所不同，最小分辨距离=0.61λ/NA，最小分辨距 离越小，分辨率越高，提高物镜的数值孔径NA，或者缩短光的波长λ，都 可以提高分辨率 D: 分辨率 ； • 可见光的波长范围在390nm-670nm，而空气中的数值孔径大小最高等于1， 普通光学显微镜的极限分辨率是200nm左右。 sin( / 2) 0.61 N D 8 D: 分辨率 λ：入射光的波长 N：介质的折射率（1或1.5） α：物镜的镜口角 介质 空气 水 香柏油 α溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66
2017/9/12 光学显微镜样品制备技术 石蜡切片的制备程序 取材→圆定包埋一初片染色十观察 y7 (二)、相差显微镜(phase contrast microscope) 的振幅差显微镜（将相位差转变成振幅差（明暗差）的显徽镜)，提高了密度不 同物质图像的明暗区别，可用于观察未经染色的细胞结构。 梁换卖射的光（视野中背景光）与经物体行射的光分开：②将大约一半的波长从相位 晨装程结醒告竿反能留战告喜 光落 5
2017/9/12 5 石蜡切片的制备程序 光学显微镜样品制备技术 9 （二)、相差显微镜（phase contrast microscope） • 相差显微镜:利用光干涉现象将透过标本的光线光程差或相位差转换成肉眼可分辨 的振幅差显微镜（将相位差转变成振幅差（明暗差）的显微镜）。提高了密度不 同物质图像的明暗区别，可用于观察未经染色的细胞结构。 • ①将直射的光(视野中背景光)与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位 中除去。 • 1）环形光阑:产生同相位光束 产生同相位光束。 • 2）相位板：将直射光推迟1/4λ或将折射光推迟1/4λ • 3）合轴调节望远镜：使两束光重合产生干涉。 相差显微镜对比度的产生：反射光和散射光比非直射光落后1/2 10 波长在光路重合后干涉抵消，使切片图象比背景暗