基因工程实验指导书
基 因 工 程 实验指导书
目录实验一CTAB法分离植物组织总核酸及纯化实验二目的DNA分子的PCR扩增、染色检测与分析5实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳检测10.12实验四1DNA分子的聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染分析2
2 目 录 实验一 CTAB 法分离植物组织总核酸及纯化.3 实验二 目的 DNA 分子的 PCR 扩增、染色检测与分析 .5 实验三 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测.10 实验四 DNA 分子的聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染分析.12
实验一CTAB法分离植物组织总核酸及纯化1实验目的分离和制备符合基因操作实验所用的高质量DNA分子。2实验原理植物细胞中DNA位于细胞核和细胞质中，分离植物总DNA首先要破碎细胞壁，然后用SDS、CTAB、PEX等试剂裂解细胞膜系统，释放DNA到DNA提取介质中。然后使DNA与蛋白质、多糖、多酚类物质分开，在乙醇或异丙醇作用下沉淀DNA。3实验材料与试剂：实验材料：高粱叶片实验用仪器：高速冷冻离心机、水浴锅、移液器、离心管（2mL.1.5mL）、吸头（1mL.200uL10uL)。试剂：CTAB、NaCI、EDTA、Tris.base、β-巯基乙醇、异丙醇、醋酸钠。试剂的配置：（1）DNA提取缓冲液(DNAextractionbuffer)①1×CTAB提取缓冲液2×CTAB提取缓冲液50mmol/L TrisCI pH 8.0100 mmol/LTris.Cl pH8.00.7mol/LNaCI1.4 mol/L NaCI10mmol/LEDTA20mmol/LEDTA1% CTAB2%CTAB0.1~2%β-筑基乙醇0.1~2%β-巯基乙醇玉米CTAB提取缓冲液（来源于CIMMYT）终浓度储存液50 mL100mL200mLddHO32.5 mL65.0 mL130.0 mL1 M Tris-7.5100mmol/L5.0 mL10.0mL20.0 mL700mmol/L5 M NaCI7.0 mL14.0mL28.0mL0.5MEDTA-8.050 mmol/L5.0mL10.0 mL20.0 mLCTAB?1 %0.5 g1.0 g2.0 g14 M BME3140mmol/L0.5mL1.0 mL2.0mLUse freshly made; warm buffer to 60-65°C before adding the CTAB and BME12.CTAB=Mixed alkyltrimethyl-ammonium bromide (Sigma M-7635)Add BME (β-mercaptoethanol) just prior to use, under a fume hood.3.②SDS提取缓冲液100 mmol/LTris.CI pH 8.0100mmol/LNaCl50mmol/LEDTA2% SDS(2)1×TE:10 mmol/L Tris.CI pH8.0;1mmol/LEDTApH8.03
3 实验一 CTAB 法分离植物组织总核酸及纯化 1 实验目的 分离和制备符合基因操作实验所用的高质量 DNA 分子。 2 实验原理 植物细胞中 DNA 位于细胞核和细胞质中，分离植物总 DNA 首先要破碎细胞壁，然后用 SDS、CTAB、PEX 等试剂裂解细胞膜系统，释放 DNA 到 DNA 提取介质中。然后使 DNA 与蛋白质、多糖、多酚类物质分开，在乙醇或异丙醇作用下沉淀 DNA。 3 实验材料与试剂： 实验材料：高粱叶片 实验用仪器：高速冷冻离心机、水浴锅、移液器、离心管（2mL,1.5mL）、吸头（1mL, 200uL, 10uL）。 试剂：CTAB、NaCl、EDTA、Tris.base、β-巯基乙醇、异丙醇、醋酸钠。 试剂的配置： （1）DNA 提取缓冲液 (DNA extraction buffer) ① 1× CTAB 提取缓冲液 2×CTAB 提取缓冲液 50 mmol/L TrisCl pH 8.0 100 mmol/L Tris.Cl pH 8.0 0.7 mol/L NaCl 1.4 mol/L NaCl 10 mmol/L EDTA 20 mmol/L EDTA 1% CTAB 2% CTAB 0.1~2% β-巯基乙醇 0.1~2% β-巯基乙醇 玉米 CTAB 提取缓冲液 1（来源于 CIMMYT） 储存液 终浓度 50 mL 100 mL 200 mL ddH2O 32.5 mL 65.0 mL 130.0 mL 1 M Tris-7.5 100 mmol/L 5.0 mL 10.0 mL 20.0 mL 5 M NaCl 700 mmol/L 7.0 mL 14.0 mL 28.0 mL 0.5 M EDTA-8.0 50 mmol/L 5.0 mL 10.0 mL 20.0 mL CTAB2 1 % 0.5 g 1.0 g 2.0 g 14 M BME3 140 mmol/L 0.5 mL 1.0 mL 2.0 mL 1． Use freshly made; warm buffer to 60-65°C before adding the CTAB and BME. 2． CTAB = Mixed alkyltrimethyl-ammonium bromide (Sigma M-7635). 3． Add BME (β-mercaptoethanol) just prior to use, under a fume hood. ② SDS 提取缓冲液 100 mmol/L Tris.Cl pH 8.0 100 mmol/L NaCl 50 mmol/L EDTA 2 % SDS （2）1×TE： 10 mmol/L Tris.Cl pH8.0； 1 mmol/L EDTA pH8.0
(3)3mol/LNaOAcpH5.2;（4）预冷的异丙醇注：【CTAB：十六烷基三甲基溴化铵、SDS：十二烷基磺酸钠、BME：β巯基乙醇，抗氧化剂（抗坏血酸钠、磷酸吡哆醛PVP))4实验操作步骤：1)植物叶片2~3g在液氮中研磨，装如2mL离心管中。2)加800uL提取缓冲液，充分混匀。3)65℃水浴60min，每隔15min混匀一次，应避免剧烈晃动。4)冷却到室温后加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀15min。5)8000rpm离心20min。6)取上清，加等体积的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀。7)8000rpm离心20min。8)取上清，加1/10体积的3mol/LNaOAc(pH5.2)，0.8×体积预冷的异丙醇，混匀，置-20℃1h。勾出或10000rpm离心20min，沉淀DNA。9)10）70%酒精洗沉淀2次。11）风干DNA样品，加适量TE溶解DNA，置-20℃备用。12）取适量DNA，琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测。5作业：（1）用CTAB方法制备植物DNA的操作过程中应注意那些事项？（2）DNA提取液中各种成分如SDS、CTAB、EDTA、NaCI、β-筑基乙醇等的作用是什么？（3）根据你所制备的DNA的琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测结果（附图），分析提取的DNA质量如何？有无降解？如有降解（在泳道中可见弥散状DNA），请分析可能产生的原因。根据实验3中提供的方法，估算所制备的DNA样品的量。4
4 （3）3mol/L NaOAc pH 5.2 ； （4） 预冷的异丙醇 注：【CTAB：十六烷基三甲基溴化铵、SDS：十二烷基磺酸钠、BME：β 巯基乙醇，抗 氧化剂（抗坏血酸钠、磷酸吡哆醛 PVP）】 4 实验操作步骤： 1) 植物叶片 2~3g 在液氮中研磨, 装如 2mL 离心管中。 2) 加 800 uL 提取缓冲液, 充分混匀。 3) 65℃ 水浴 60 min，每隔 15min 混匀一次，应避免剧烈晃动。 4) 冷却到室温后加等体积的酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1), 充分混匀 15min。 5) 8 000rpm 离心 20min。 6) 取上清, 加等体积的氯仿/异戊醇 (24:1), 充分混匀。 7) 8 000 rpm 离心 20 min。 8) 取上清, 加 1/10 体积的 3 mol/L NaOAc (pH5.2), 0.8×体积预冷的异丙醇, 混匀, 置 -20 ℃ 1h。 9) 勾出或 1 0000 rpm 离心 20min, 沉淀 DNA。 10) 70% 酒精洗沉淀 2 次。 11) 风干 DNA 样品, 加适量 TE 溶解 DNA, 置 -20 ℃ 备用。 12) 取适量 DNA，琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测。 5 作业： （1）用 CTAB 方法制备植物 DNA 的操作过程中应注意那些事项？ （2） DNA 提取液中各种成分如 SDS、CTAB、EDTA、NaCl、β-巯基乙醇等的作用是什么？ （3） 根据你所制备的 DNA 的琼脂糖琼脂糖凝胶电泳检测结果（附图），分析提取的 DNA 质量如何？有无降解？如有降解（在泳道中可见弥散状 DNA），请分析可能产生的原因。根 据实验 3 中提供的方法，估算所制备的 DNA 样品的量
实验二目的DNA分子的PCR扩增、染色检测与分析1实验目的通过该实验掌握PCR反应原理，PCR操作的基本步骤以及对PCR反应结果的检测分析。2实验原理1.1聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3'末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的折增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg*等。（1）模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。（2）模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。退火时间一般为1~2min。（3）引物的延伸DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，TaqDNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。1.2PCR反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg。引物：引物设计应遵循以下原则：（1）引物长度。长度要求在15～30bp，常用为20bp左右，引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。（2）引物碱基构成。引物的G+C含量以40～60%为宜，因为G+C含量过高或过低都会5
5 实验二 目的 DNA 分子的 PCR 扩增、染色检测与分析 1 实验目的 通过该实验掌握 PCR 反应原理，PCR 操作的基本步骤以及对 PCR 反应结果的检测分析。 2 实验原理 1.1 聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR 基本原理是以单链 DNA 为模板，4 种 dNTP 为底物，在模板 3’末端有引物存在的 情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩 增。在微量离心管中，加入与待扩增的 DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量 的缓冲液、微量的 DNA 膜板、四种 dNTP 溶液、耐热 Taq DNA 聚合酶、Mg2+等。 （1）模板 DNA 的变性 模板 DNA 加热到 90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为 DNA 的变性。变性温度与 DNA 中 G-C 含量有关，G-C 间由三个氢键连接，而 A-T 间只有两个氢 键相连，所以 G-C 含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故 PCR 中 DNA 变性需要的温 度和时间与模板 DNA 的二级结构的复杂性、G-C 含量高低等均有关。 （2）模板 DNA 与引物的退火 将反应混合物温度降低至 37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成 DNA 模板- 引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基 组成。退火时间一般为 1~2 min。 （3）引物的延伸 DNA 模板-引物复合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模 板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板 DNA 链互补的新链。延伸所需要的时 间取决于模板 DNA 的长度。在 72℃条件下，Taq DNA 聚合酶催化的合成速度大约为 40～60 个碱基/秒。 1.2 PCR 反应的五个元素 参与 PCR 反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。 引物：引物设计应遵循以下原则： （1）引物长度。长度要求在 15～30bp，常用为 20bp 左右，引物过短时会造成 Tm 值过 低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成 Tm 值过高，超过酶反应 的最适温度，且合成长引物还会使费用大大增加。 （2）引物碱基构成。引物的 G+C 含量以 40～60%为宜，因为 G+C 含量过高或过低都会