直接造成Tm值的过高或过低，都不利PCR反应的进行。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。（3）引物二级结构。应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补结构，特别是3"端的互补，否则形成引物二聚体，PCR扩增中产生非特异的条带。引物自身也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。（4）引物3端序列。3端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过15bp，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。（5）引物中酶切位点的引入。引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR克隆基因时已将后续方案设计完毕。（6）引物的特异性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。（7）引物量。反应体系中引物的常用浓度为0.1～1pmol/mL，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。酶及其浓度：TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。具有5→3"的聚合酶活力，5°-→3的外切核酸酶活力，无3°→5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-～10。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性在90%以上，在93℃下反应2h后其残留活性是仍能保持60%，而在95℃下反应2h后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。一典型的PCR反应约需的酶量为1U（总反应体积为25uL时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度：在PCR反应中，dNTP应为50～200μumol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg*结合，使游离的Mg*浓度降低。模板DNA6
6 直接造成 Tm 值的过高或过低，都不利 PCR 反应的进行。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以 上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 （3）引物二级结构。应尽量避免引物内部出现二级结构，并且两条引物间不能形成互补 结构，特别是 3’端的互补，否则形成引物二聚体，PCR 扩增中产生非特异的条带。引物自身 也应无回文对称结构（限制性酶切位点除外），防止形成茎环结构。 （4）引物 3’端序列。3’端碱基要求与模板严格配对，连续配对的碱基数超过 15bp，以 避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。 （5）引物中酶切位点的引入。引物中一般会引入一至两个酶切位点，便于后期的克隆实 验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中，PCR 克隆基因时已将后续方案设计完 毕。 （6）引物的特异性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，特别是与待扩 增的模板 DNA 之间要没有明显的相似序列。 （7）引物量。反应体系中引物的常用浓度为 0.1～1pmol/mL，以最低引物量产生所需要 的结果为好，引物浓度偏高会在反应过程中形成二聚体，过低则扩增效率会降低。 酶及其浓度： Taq DNA 多聚酶是耐热 DNA 聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。 具有 5’→3’的聚合酶活力，5’ →3’的外切核酸酶活力，无 3’ →5’的外切核酸酶活力，会在 3’ 末端不依赖模板加入 1 个脱氧核苷酸（通常为 A，故 PCR 产物克隆中有与之匹配的 T 载体）， 在体外实验中，Taq DNA 聚合酶的出错率为 10-4～10-5。此酶具有以下特点： （1）耐高温，在 70℃下反应 2h 后其残留活性在 90%以上，在 93℃下反应 2h 后其残留 活性是仍能保持 60%，而在 95℃下反应 2h 后为原来的 40%。 （2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。 （3）一般扩增的 PCR 产物长度可达 2.0 kb，且特异性也较高。 一典型的 PCR 反应约需的酶量为 1U（总反应体积为 25uL 时），浓度过高可引起非特异 性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP 的质量与浓度： 在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200μmol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等（等 摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过 低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板 DNA
模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理样本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~1Ong/uL，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板量往往会导致PCR实验的失败。Mg*浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，Mg+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。1.3PCR反应条件温度与时间的设置：标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。1.4PCR反应特点（1）强特异性PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异性的结合：②碱基配对原则③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性：④靶基因的特异性与保守性。（2）高灵敏度PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-2g）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=10~g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。（3）快速简便PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行7
7 模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通 常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理样本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白 质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽） 抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于 PCR 反应。 模板 DNA 投入量对于细菌基因组 DNA 一般在 1~10ng/uL，实验中模板浓度常常需要优 化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以 10 倍为一个梯度）。在 PCR 反应中，过高的模板量 往往会导致 PCR 实验的失败。 Mg2+浓度 Mg2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的 PCR 反应中， Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L 为宜。Mg2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降 低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。 1.3 PCR 反应条件 温度与时间的设置：标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90～95℃变性，再迅速 冷却至 40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70～75℃，在 Taq DNA 聚 合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 1.4 PCR 反应特点 （1）强特异性 PCR 反应的特异性决定因素为： ① 引物与模板 DNA 特异性的结合； ② 碱基配对原则； ③ Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性； ④ 靶基因的特异性与保守性。 （2）高灵敏度 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg =10-12 g）量级的起始待测模板扩 增到微克（ug = 10-6 g）水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。 （3）快速简便 PCR 反应用耐高温的 Taq DNA 聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在 PCR 仪上进行