《生物化学实验技术》实验指导书
1 《生物化学实验技术》 实验指导书
目录实验一DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖.3实验二氨基酸的纸层析5实验三醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白实验四9影响酶作用的因素，实验五蛋白质的盐析沉淀和变性反应..12实验六卵磷脂的提取与鉴定..14实验七淀粉酶活性测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）..16实验八粗脂肪的提取与检测.18
2 目 录 实验一 DNS（3，5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖 .3 实验二 氨基酸的纸层析.5 实验三 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白.7 实验四 影响酶作用的因素.9 实验五 蛋白质的盐析沉淀和变性反应.12 实验六 卵磷脂的提取与鉴定.14 实验七 淀粉酶活性测定（3，5-二硝基水杨酸比色法） .16 实验八 粗脂肪的提取与检测.18
实验一DNS（3.5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖一、实验目的掌握还原糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，燕糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基一5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。COOHCOOHIOH.OH加热+还原糖碱性O2NNH2O2NNO2三、实验材料、主要仪器和试剂1.实验材料小麦面粉；精密pH试纸。2.主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mLX1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1：2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）电子天平（11）分光光度计3.试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂称取6.5gDNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。四、操作步骤1.制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。3
3 实验一 DNS（3,5-二硝基水杨酸）比色法测定还原糖 一、实验目的 掌握还原糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原 糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶 解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸 水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄 糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3- 氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度 计，在 540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由 于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以 0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 小麦面粉；精密 pH 试纸。 2． 主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11 （2）大离心管：50mL×2 （3）烧杯：100mL×1 （4）三角瓶：100mL×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1 （7）恒温水浴锅 （8）沸水浴 （9）离心机 （10）电子天平 （11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL 葡萄糖标准液 准确称取 80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖 100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到 100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至 100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 称取 6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入 1000mL 容量瓶中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 325mL，再加入 45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000mL。 四、操作步骤 1．制作葡萄糖标准曲线 取 7 支 20mL 具塞刻度试管编号，按表 1 分别加入浓度为 1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和 3,5- 二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液
表1葡萄糖标准曲线制作蒸馏水DNS1mg/mL葡萄糖标准液葡萄糖含量光密度值管号(mL)(mL)(mL)(mg)(ODs40m)2001. 5010. 21.81. 50. 220. 41.61. 50. 430. 61. 41. 50. 640.81. 50.81. 251. 01. 01.51.061. 20. 81. 51. 2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，用流动水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。2．样品中还原糖的测定（1）还原糖的提取准确称取0.50g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入40mL蒸馅水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用5mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在50mL容量瓶中，或将浸出液（含沉淀）过滤到50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。（2）显色和比色取2支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2样品还原糖测定DNS蒸馏水还原糖待测液光密度值查曲线葡萄糖量管号(mL)(mL)(mL)(ODs40m)(mg)70. 51. 51. 581. 51. 50.5五、结果与计算：计算出7、8号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。提取液总体积查曲线所得葡萄糖毫数×测定时取用体积100%还原糖%)=样品毫克数六、注意事项（1）离心时对长称位置的离心管必须配平。（2）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色七、思考题1．比色时为什么要设计空白管？2.如何正确绘制和使用标准曲线？4
4 表 1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/mL 葡萄糖标准液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 葡萄糖含量 （mg） 光密度值 （OD540nm） 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热 5min，取出，用流动水迅速冷却至室温，用蒸馏水定容至 20mL， 加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长 540nm，用 0 号管调零点，测出 1~6 号管的光密 度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2．样品中还原糖的测定 （1）还原糖的提取 准确称取 0.50g 食用面粉，放入 100mL 烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入 40mL 蒸馏水， 搅匀，置于 50℃恒温水浴中保温 20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到 50mL 离心管中， 于 4 000r/min 下离心 5min，沉淀可用 5mL 蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在 50mL 容量瓶中，或将浸出液（含沉淀）过滤到 50mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待 测液。 （2）显色和比色 取 2 支 20mL 具塞刻度试管，编号，按表 2 所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标 准曲线的 0 号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 表 2 样品还原糖测定 管 号 还原糖待测液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 光密度值 （OD540nm） 查曲线葡萄糖量 （mg） 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 五、结果与计算： 计算出 7、8 号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算 出样品中还原糖和总糖的百分含量。 % 100% 样品毫克数 测定时取用体积 提取液总体积 查曲线所得葡萄糖毫克数 还原糖（ ） 六、注意事项 （1）离心时对长称位置的离心管必须配平。 （2）标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色 七、思考题 1．比色时为什么要设计空白管？ 2．如何正确绘制和使用标准曲线？
实验二氨基酸的纸层析一、实验目的1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。2.学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的操作技术。二、实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的一OH基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析：反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用Rf表示。Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离只要实验条件（如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数，因此可做定性分析参考。由于氨基酸无色，可利用三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。三、仪器和试剂1.仪器层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、喷雾器、毛细管、吹风机、直尺、铅笔等。2.试剂（1）混合氨基酸溶液（水解后的氨基酸干粉）甘氨酸溶液：25mg甘氨酸溶于5mL水中。蛋氨酸溶液：25mg蛋氨酸溶于5mL水中。亮氨酸溶液：25mg亮氨酸溶于5mL水中。氨基酸混合液：甘氨酸25mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg共溶于5mL水中。（2）展层溶剂正丁醇：冰乙酸：水=4：1：3（V/V)，充分振荡，静置分层后，放出下层水层，取上层溶液备用。（3）显色贮备液：0.1%水合三酮正丁醇溶液。四、实验步骤1.画基线戴上指套或橡皮手套，在长约15cm、宽约14cm滤纸上，距短边2cm处，用铅笔画一条线，即为基线。2.点样在原线上，从距纸的长边4cm处开始，每隔3cm用毛细管依次分别点上甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和混合氨基酸溶液。点样点干后可重复点加1～2次。每一点的直径不超过3mm。3.展层将点好样的滤纸卷成筒形，滤纸两边不相接触，用线固定好，将原线的下端浸入盛有溶剂的培养皿中，立即展层。基线必须保持在液面之上，以免氨基酸与溶剂直接接触。盖好层析缸，当溶剂前沿距纸端3cm时，取出滤纸，记下溶剂前沿位置。4.显色滤纸取出后，吹干，均匀喷涂水合三酮显色液，静置1-2min，电吹风吹干即出现紫红色的氨基5
5 实验二 氨基酸的纸层析 一、实验目的 1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 2.学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的操作技术。 二、实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶 剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固 定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移 动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由 于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。 氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用 Rf 表示。Rf = 原 点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，Rf 值是常数，因此可做定性 分析参考。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。 三、仪器和试剂 1．仪器 层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、喷雾器、毛细管、吹风机、直尺、铅笔等。 2．试剂 （1）混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液：25mg 甘氨酸溶于 5mL 水中。 蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于 5mL 水中。 亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于 5mL 水中。 氨基酸混合液： 甘氨酸 25mg，亮氨酸 25mg，蛋氨酸 25mg 共溶于 5mL 水中。 （2）展层溶剂 正丁醇∶冰乙酸∶水 = 4∶1∶3(V/V)，充分振荡，静置分层后，放出下层水层，取上层溶液备用。 （3）显色贮备液： 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 四、实验步骤 1.画基线 戴上指套或橡皮手套，在长约 15cm、宽约 14cm 滤纸上，距短边 2 cm 处，用铅笔画一条线，即 为基线。 2.点样 在原线上，从距纸的长边 4cm 处开始，每隔 3cm 用毛细管依次分别点上甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸 和混合氨基酸溶液。点样点干后可重复点加 1～2 次。每一点的直径不超过 3mm。 3.展层 将点好样的滤纸卷成筒形，滤纸两边不相接触，用线固定好，将原线的下端浸入盛有溶剂的培养 皿中，立即展层。基线必须保持在液面之上，以免氨基酸与溶剂直接接触。盖好层析缸，当溶剂前沿 距纸端 3cm 时，取出滤纸，记下溶剂前沿位置。 4.显色 滤纸取出后，吹干，均匀喷涂水合茚三酮显色液，静置 1-2min，电吹风吹干即出现紫红色的氨基