安装仪器时，先将冷凝器垂直地固定在铁支台上，冷凝器下端不要距离实验台太 近，以免放不下吸收瓶。然后将反应管通过磨口连接(图中10)与冷凝器相连，根据仪器本身的 角度将反应管固定在另一铁支台上。这一点务须注意，否则容易引起氨的散央及反应室上端弯管折断。然后格蒸汽 发生器放在电炉上，并用橡皮管把蒸汽发生器与反应管连接起来，安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。 2．样品处理： 某一固体样品中的含氮量是用100克该物质(干重)中所含氮的克数来表示(％)。因 此在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因 为非游离的水，都不能在100℃以下烘干。 在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用柑蜗 钳将称量瓶放入干煤器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每千操1 小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达桓重。若样品为液体(如血清等)， 可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取0．1克左右的干燥植物组织作为本实验的样品。 3．消化： 取四个100毫升凯氏烧瓶并标号。各加l1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0．1 克，催化剂200毫克，浓硫酸5毫升，注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口 和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0．1毫升蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫 酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通 风橱内的电炉上消化。 在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分 解并放出SO 白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消 化完毕，等烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶 内容物倾入50毫升的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入量瓶，用水稀释 到刻度，混匀备用。 4．蒸馏： (1)蒸馏器的洗涤：蒸汽发生器中盛有用几滴硫酸酸化的蒸馏水。关闭皮管夹7， 将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过整个仪器。约15分钟后，在冷凝器下端放一个 盛有5毫升2％硼酸溶液和1—2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图，冷凝器下端 应完全浸没在液体中，继续蒸汽洗涤l一2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不 变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约 1厘米继续通蒸汽1分钟。最后用水冲洗冷凝管口，然后用手捏紧橡皮管3，由于反应 室外层蒸气冷缩，压力减低，反应室内凝结的水可自动吸出进入6，打开皮夹7，将 废水排出。 (2)蒸馏：取50毫升锥形瓶数个，各加5毫升硼酸和1—2滴指示剂，溶液呈紫色， 用表面皿复盖备用。 用吸管取10毫升消化液，细心地由蒸馏器小玻坏注入反应室，塞紧玻棒玻塞。将 一个合有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下，使冷凝器下端浸没在液体内。 2
用量筒取30％的氢氧化钠溶液10毫升放人小玻璃杯(图中4)，轻提棒状玻璃塞使 之流人反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流入时， 将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约5毫升。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢 流入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧夹子7开始 蒸馏。此时锥形瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。自变色时起记时，蒸馏3—5分钟。移 动锥形瓶使硼酸液面离开冷授管约1厘米并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面。继续蒸 馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿复盖锥形瓶。 蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净。在小玻璃杯中倒入蒸馏水，待蒸气很足、反 应室外壳6温度很高时，一手轻提棒状玻璃塞使冷水流入反应室，同时立即用另一只 手捏紧橡皮管3，则6内蒸气冷缩，可将5中残液自动吸出，再用蒸馏水自4倒入5，重 复上述操作。如此冲洗几次后，将7打开，将o中废校排出。再继续下一个蒸馏操作。 待样品和空白消化液均蒸馏完毕后，同时进行滴定。 (3)滴定：全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸 指示剂溶液由绿变谈紫色为滴定终点。 五、实验要求 同上 六、场地、设备与器材 12幢新实验大楼1楼生化实验室 1、50ml凯氏烧瓶 2、凯氏定氮蒸馏装置 3、100ml锥形瓶 4、25ml酸式滴定管 5、分析天平 6、烘箱 7、电炉 8、1000ml蒸馏烧瓶 9、小玻璃珠 《生物化学实验B》课程实验项目4 一、实验目的 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 4．熟悉蛋白质的沉淀反应 5．进一步掌握蛋白质的有关性质 二、实验内容 蛋白质的呈色和沉淀、变性反应 三、实验原理
(一)双缩脲反应： 1.原理： 尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中能与 cu 结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构 与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都 是蛋白质或多肽。 (二)茚三酮反应 1.原理： 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白 质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。 该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用 的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO 、NH 和醛，水合茚三酮 被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和 氨缩合生成有色物质。 此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深 浅不同，酸度过大时甚至不显色。 (三)黄色反应： 1.原理： 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该 化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子台有带苯坏的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需 加入少量浓硫酸才有黄色反应。 (四)沉淀反应： 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗 粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分为两类。 (1)可逆的沉淀反应： 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作 用或在低温下用乙醇(或丙酮)短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反 应。 (2)不可逆沉淀反应： 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶 剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属 于此类。 2+ 2 3
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在(如电荷)，并不析出。因 此变性蛋白质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 四、实验方法与步骤 (一)双缩脲反应： 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬 化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升， 振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫 酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加 1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。 (二)茚三酮反应 取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮 水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的 茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 (三, )黄色反应： 于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴，加热，冷却后再加10%NaOH溶液5 滴，观察颜色变化。 (四)沉淀反应： (1)蛋白质的盐析。 无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出 的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析 出。 由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析 作用是可逆过程。 加5％卵清蛋白溶液5毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数 分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？将管 内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l此时析出的沉淀为清蛋 白。取出部分清蛋 白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。 （2）乙醇沉淀蛋白质 乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。 取蛋白质溶液1ml,加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后加入 95%乙醇2ml混匀。观察有无沉淀析出。 （3）重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀