第一部分植物组织培养技术实验一培养基的制作目的要求（一）熟练掌握常用培养基母液的制备方法。（二）熟练掌握配制MS工作培养基的基本技能和培养基的灭菌方法。：（三）熟练掌握常用仪器设备的使用方法。实验内容一、培养基母液的配制（一）原理培养基主要是由水分、无机物质、有机物质、天然复合物质和凝固剂（或培养体的支持材料）五部分构成。在植物组织培养中，配制培养基是经常性的工作。为了准确称量和快速移取，以及便于贮藏，通常是把培养基先配制成一系列浓缩液，即母液。母液的浓缩倍数一般为10～100倍，可分为大量元素母液、微量元素母液、有机物质母液（维生素、氨基酸等）、铁盐母液和激素类母液等。（二）用品配制MS培养基所需药品：生长调节剂（2，4一D、NAA、IBA、6-BA）：电子天平6台（其中1台为1/1000，1台为1/10000）：500ml烧杯6个；100ml烧杯6个：量筒（1000ml）6个：量筒（500ml）6个：量筒（10ml）12个：容量瓶（1000ml）3个；容量瓶（100ml）3个：各类移液管数只蒸馏水：95%酒精；0.1mol/LNa0H：0.1mol/LHCL；棕色细口母液瓶（1000ml、500ml、100ml）：标签纸3张：冰箱1台；微波炉等。（三）方法与步骤1、MS基本培养基配方：MS培养基化合物用量（mg/L）制备母液应称取量（g）NH, · NO165016.5大量元素190019KNO3MgSO, · 7H,03703. 7KH,PO,1701. 74. 4CaCL,·2H,0440微量元素FeSO,·7H,027.81.39Na2-EDTA37.31.86522.31.115MnSO,:4H,08.6ZnSO,·7H,00.43CoCL,·6H,00.0250.001250.025CuSO,·5H,00.001250.25NaMo,·2H,00.0125KI0.830.0415H,BO,6. 20.31有机物质烟酸（Vpp）0.50.0125盐酸吡哆醇（VB）0.50.01250. 1盐酸硫胺素（VB）0.0025肌醇1002.52甘氨酸0.05
1 第一部分 植物组织培养技术 实验一 培养基的制作 目的要求 （一）熟练掌握常用培养基母液的制备方法。 （二）熟练掌握配制 MS 工作培养基的基本技能和培养基的灭菌方法。； （三）熟练掌握常用仪器设备的使用方法。 实验内容 一、培养基母液的配制 （一）原理 培养基主要是由水分、无机物质、有机物质、天然复合物质和凝固剂（或培养体的支持材料）五 部分构成。 在植物组织培养中，配制培养基是经常性的工作。为了准确称量和快速移取，以及便于贮藏，通 常是把培养基先配制成一系列浓缩液，即母液。母液的浓缩倍数一般为 10～100 倍，可分为大量元 素母液、微量元素母液、有机物质母液（维生素、氨基酸等）、铁盐母液和激素类母液等。 （二）用品 配制 MS 培养基所需药品；生长调节剂（2，4－D、NAA、IBA、6－BA）；电子天平 6 台（其中 1 台为 1/1000,1 台为 1/10000）；500 ml 烧杯 6 个；100 ml 烧杯 6 个；量筒（1000 ml）6 个；量筒 （500 ml）6 个；量筒（10 ml）12 个；容量瓶（1000ml）3 个；容量瓶（100ml）3 个；各类移液管 数只；蒸馏水；95%酒精；0.1mol∕L NaOH；0.1mol∕L HCL；棕色细口母液瓶（1000 ml、500 ml、 100 ml）；标签纸 3 张；冰箱 1 台；微波炉等。 （三）方法与步骤 1、MS 基本培养基配方： MS 培养基 化合物 用量（mg∕L） 制备母液应称取量（g） 大量元素 NH4·NO3 1650 16.5 KNO3 1900 19 MgSO4·7H2O 370 3.7 KH2PO4 170 1.7 CaCL2·2H2O 440 4.4 微量元素 FeSO4·7H2O 27.8 1.39 Na2-EDTA 37.3 1.865 MnSO4·4H2O 22.3 1.115 ZnSO4·7H2O 8.6 0.43 CoCL2·6H2O 0.025 0.00125 CuSO4·5H2O 0.025 0.00125 Na2Mo4·2H2O 0.25 0.0125 KI 0.83 0.0415 H3BO3 6.2 0.31 有机物质 烟酸（Vpp） 0.5 0.0125 盐酸吡哆醇（VB6） 0.5 0.0125 盐酸硫胺素（VB1） 0.1 0.0025 肌醇 100 2.5 甘氨酸 2 0.05
2、配制方法与步骤（1）10倍大量元素母液（1000m1）的配制1）称取NH,NO16.5g，KNO,19g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解：称取KH,P0,1.7g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解：称取MgS04·7H,03.7.g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解：称取CaCL，·2H,04.4g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解（也可单独配制成100倍母液）。化合物称取量（g）培养基浓度（mg/L)16.5NH, · NO.165019KNO,19003.7370MgSO,·7H,01.7170KH,PO,4.4440CaCL·2H,02）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品：3）定容：加蒸馏水定容至1000ml，即成浓缩10倍的大量元素母液。（2）100倍的微量元素母液（1000m1）的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H,BO0.62gMnSO.4H,02.230.86gKI0.083gNaMo,·2H00.025gCuS0,·5H200.0025gg ZnSO,7H,0CoCL，·6H00.0025g加少量蒸馏水（约600ml）溶解；2）定容：溶解后的上述溶液转入1000ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成100倍的微量元素母液。5100倍的微量元素母液（500m1）的配制1)称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H,B0，0.31gMnS0,.4H01.120.43gKI0.042gNaMo·2H,00.0125g CuS0,·5H,00.0013ggZnSO,·7H,0CoCL·6H,00.0013g加少量蒸馏水（约200ml）溶解：2）定容：溶解后的上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的微量元素母液。化合物培养基浓度（mg/L)称取量（g）MnSO,· 4H,01.11522.30.438.6ZnSO,·7H,0CoCL,·6H,00.001250. 025CuSO,·5H,00.001250.0250.01250.25Na2Mo,·2H,0KI0.04150.83H,BO,0.316. 2（3）100倍铁盐母液（500m1）的配制1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解；FeS0,·7H,01.39gNa,-EDTA1.865g2）混合：于500ml烧杯中依次混和两种溶液；3）定容：上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的铁盐母液。培养基浓度（mg/L)化合物称取量（g）1.3927. 8FeSO,·7H,0Na,-EDTA1.86537.32
2 2、配制方法与步骤 （1）10 倍大量元素母液（1000ml）的配制 1）称取 NH4NO3 16.5g，KNO3 19 g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解；称取 KH2PO41.7 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解；称取 MgSO4·7H2O 3.7 g 放入烧杯中，用少量蒸馏 水（约 100ml）溶解；称取 CaCL2·2H2O 4.4 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解（也 可单独配制成 100 倍母液）。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） NH4·NO3 16.5 1650 KNO3 19 1900 MgSO4·7H2O 3.7 370 KH2PO4 1.7 170 CaCL·2H2O 4.4 440 2）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品； 3）定容：加蒸馏水定容至 1000ml，即成浓缩 10 倍的大量元素母液。 （2）100 倍的微量元素母液（1000ml）的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3BO3 0.62 g MnSO4.4H2O 2.23 g ZnSO4·7H2O 0.86 g KI 0.083 g Na2Mo4·2H2O 0.025 g CuSO4·5H2O 0.0025 g CoCL2·6H2O 0.0025 g 加少量蒸馏水（约 600ml）溶解； 2）定容：溶解后的上述溶液转入 1000 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成 100 倍的微量元素母液。 100 倍的微量元素母液（500ml）的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3BO3 0.31 g MnSO4.4H2O 1.12 g ZnSO4·7H2O 0.43 g KI 0.042 g Na2Mo4·2H2O 0.0125 g CuSO4·5H2O 0.0013 g CoCL2·6H2O 0.0013 g 加少量蒸馏水（约 200ml）溶解； 2）定容：溶解后的上述溶液转入 500 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩 100 倍的微量元素 母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） MnSO4·4H2O 1.115 22.3 ZnSO4·7H2O 0.43 8.6 CoCL2·6H2O 0.00125 0.025 CuSO4·5H2O 0.00125 0.025 Na2Mo4·2H2O 0.0125 0.25 KI 0.0415 0.83 H3BO3 0.31 6.2 （3）100 倍铁盐母液（500 ml）的配制 1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约 100ml）溶解； FeSO4·7H2O 1.39 g Na2-EDTA 1.865 g 2）混合：于 500 ml 烧杯中依次混和两种溶液； 3）定容：上述溶液转入 500 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩 100 倍的铁盐母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） FeSO4·7H2O 1.39 27.8 Na2-EDTA 1.865 37.3
（4）50倍有机物质母液（500m1）的配制1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇2.5g甘氨酸0.05g烟酸（Vpp）0.0125g盐酸吡哆醇（VB）0.0125g盐酸硫胺素（VB,）0.0025g用少量蒸馅馏水（约300ml）溶解2）定容：上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩50倍的有机物质母液。化合物称取量（g）培养基浓度（mg/L)0. 5烟酸（Vpp)0.01250. 5盐酸吡哆醇（VB）0.01250. 1盐酸硫胺素（VB,）0.0025肌醇2.51002甘氨酸0.05（5）激素类母液的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各0.1g：IBA、NAA、2.4一D：6一BA。2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2.4一D）可先用少量0.1mo1/LNaOH或95%酒精溶解：细胞分裂素类（6一BA）可先用0.1mol/L的HCL溶解：3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg/ml的激素类母液。3、母液的保存（1）装瓶：将配制好的各母液分别转入试剂瓶中，贴上标签，注明培养基名称、母液名称、浓缩倍数、配制日期以及配制1L工作培养基时应移取的量。（2）储藏：将各母液瓶放入冰箱内低温保藏。（四）作业（一）简述各种母液的配制方法与注意事项：（二）熟悉MS基本培养基的配方组成
3 （4）50 倍有机物质母液（500 ml）的配制 1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇 2.5 g 甘氨酸 0.05 g 烟酸（Vpp） 0.0125 g 盐酸吡哆醇（VB6） 0.0125 g 盐酸硫胺素（VB1） 0.0025 g 用少量蒸馏水（约 300ml） 溶解 2）定容：上述溶液转入 500 ml 的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩 50 倍的有机物质母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） 烟酸（Vpp） 0.0125 0.5 盐酸吡哆醇（VB6） 0.0125 0.5 盐酸硫胺素（VB1） 0.0025 0.1 肌醇 2.5 100 甘氨酸 0.05 2 （5）激素类母液的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各 0.1g：IBA、NAA、2,4－D；6－BA。 2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2,4－D）可先用少量 0.1mol∕LNaOH 或 95%酒精溶解；细胞分 裂素类（6－BA）可先用 0.1mol∕L 的 HCL 溶解； 3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至 100ml，即成浓缩至 1mg∕ml 的激素 类母液。 3、母液的保存 （1）装瓶：将配制好的各母液分别转入试剂瓶中，贴上标签，注明培养基名称、母液名称、浓 缩倍数、配制日期以及配制 1L 工作培养基时应移取的量。 （2）储藏：将各母液瓶放入冰箱内低温保藏。 （四）作业 （一）简述各种母液的配制方法与注意事项； （二）熟悉 MS 基本培养基的配方组成
二、工作培养基（MS培养基）的配制（一）原理配制工作培养基时，按照标准配方和终体积，依次量取各种母液于容量瓶（或烧杯）中，再定容至终体积即可。培养基的灭菌通常采用高温高压湿热灭菌法，即在密闭的锅体内，随着压力的上升，水的沸点也随之增加，从而大幅度提高水蒸气的温度。在121.3℃下，保持15～20min，即可达到灭菌目的。（二）用品实验内容一所配制MS培养基的各种母液；琼脂；蔗糖；蒸馏水；0.1mo1/LNaOH；0.1mol/LHCL；移液管：量筒：容量瓶；三角瓶：标签：记号笔：注射器：封口塑料：电磁炉：酸度计：高压灭菌锅等。（三）方法与步骤1、1000m1MS培养基的配制与分装（1）按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中；1）10X大量元素母液：100ml：2）100X微量元素母液：10ml：3）100X铁盐母液：10ml：4）50X有机物质母液：20ml；5)加蒸馏水至700ml左右。(2）称取610g琼脂和30g蔗糖（3）调pH：用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCL将其调到5.8左右。（3）熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢出。（4）调pH：待培养基冷却至45℃左右，用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol/LNaOH或0.1mo1/LHCL将其调到5.8左右（或用经验法）。注意：1).培养基适宜PH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HC1溶液。2)pH影响培养基的硬度。pH >6.5培养基会变硬，影响营养成分吸收。pH<5.0培养基不易凝固。3)灭菌之前，培养基的pH要比标准提高0.2一0.3个单位。（5）分装与扎口：将调好pH值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装20～30ml左右的培养基。分装后上瓶盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时期，配制人姓名或编号等。每人制备2瓶MS固体培养基，100ml培养基可分装3-4瓶，每组5人，可配制300m1培养基平均分装入10瓶中。每组需准备2瓶无菌水，4盒灭菌滤纸。2、培养基的灭菌培养基分装完成后，应在24h内灭菌。灭菌过程如下：（1）加水：（2）装锅；（3）盖盖：（4）加热；（5）排放冷空气：（6）升压保温：（7）降压排气：（8）出锅冷却。3、1便携式灭菌器和立式灭菌器的构造及使用便携式灭菌器（1）构造：便携式灭菌器主要由锅体、内胆、电热管、帘子、锅盖、气压表、放气阀、安全阀、紧定丝母等零部件构成。（2）工作原理：由于在密闭且耐压的容器内，产生的水蒸气可以超过一个大气压，即达到超过100℃的温度（灭菌温度121℃），从而达到灭菌的目的。1个大气压=0.101MPa，灭菌锅内实际压力=1个大气压+压力表指示压力。灭菌压力约2个大气压。（3）使用4
4 二、工作培养基（MS 培养基）的配制 （一）原理 配制工作培养基时，按照标准配方和终体积，依次量取各种母液于容量瓶（或烧杯）中，再定容 至终体积即可。 培养基的灭菌通常采用高温高压湿热灭菌法，即在密闭的锅体内，随着压力的上升，水的沸点也 随之增加，从而大幅度提高水蒸气的温度。在 121.3℃下，保持 15～20min，即可达到灭菌目的。 （二）用品 实验内容一所配制 MS 培养基的各种母液；琼脂；蔗糖；蒸馏水；0.1mol∕LNaOH；0.1mol∕L HCL； 移液管；量筒；容量瓶；三角瓶；标签；记号笔；注射器；封口塑料；电磁炉；酸度计；高压灭菌 锅等。 （三）方法与步骤 1、1000 ml MS 培养基的配制与分装 （1）按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中； 1）10X 大量元素母液：100ml； 2）100X 微量元素母液：10 ml；3）100X 铁盐母液：10 ml； 4）50X 有机物质母液：20 ml; 5)加蒸馏水至 700 ml 左右。 (2) 称取 6～10g 琼脂和 30g 蔗糖 （3）调 pH：用酸度计或 pH 试纸测试 pH 值，可用 0.1mol∕LNaOH 或 0.1mol∕L HCL 将其调到 5.8 左右。 （3）熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢 出。 （4）调 pH：待培养基冷却至 45℃左右，用酸度计或 pH 试纸测试 pH 值，可用 0.1mol∕LNaOH 或 0.1mol∕L HCL 将其调到 5.8 左右（或用经验法）。 注意：1).培养基适宜 PH 值 5-6.5，一般为 5.8，调整用 0.1M 的 NaOH 和 HCl 溶液 。 2)ｐH 影响培养基的硬度。 ｐH ＞6.5 培养基会变硬，影响营养成分吸收。 ｐH ＜5.0 培养基不易凝固。 3)灭菌之前，培养基的ｐH 要比标准提高 0.2－0.3 个单位。 （5）分装与扎口：将调好 pH 值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装 20～30ml 左右的培养基。分 装后拧上瓶盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时期,配制人姓名或编号等。 每人制备 2 瓶 MS 固体培养基，100 ml 培养基可分装 3-4 瓶，每组 5 人，可配制 300 ml 培养基 平均分装入 10 瓶中。每组需准备 2 瓶无菌水，4 盒灭菌滤纸。 2、培养基的灭菌 培养基分装完成后，应在 24h 内灭菌。灭菌过程如下： （1）加水；（2）装锅；（3）盖盖；（4）加热；（5）排放冷空气； （6）升压保温；（7）降压排气；（8）出锅冷却。 3、便携式灭菌器和立式灭菌器的构造及使用 便携式灭菌器 （1）构造：便携式灭菌器主要由锅体、内胆、电热管、帘子、锅盖、气压表、放气阀、安全 阀、紧定丝母等零部件构成。 （2）工作原理：由于在密闭且耐压的容器内，产生的水蒸气可以超过一个大气压，即达到超过 100℃的温度（灭菌温度 121℃），从而达到灭菌的目的。 1 个大气压=0.101MPa ,灭菌锅内实际压力=1 个大气压+压力表指示压力。灭菌压力约 2 个大气 压。 （3）使用
①打开锅盖，加入清水，至接近帘子的程度，然后装入培养物，盖上盖，对角线拧紧丝母：②接通电源，使灭菌器开始工作。当压力表指针升到0.05MPa时，打开放气阀放出冷气，直至回零，关闭放气阀，使灭菌器继续工作。③当压力达到0.10MPa时，开始计算时间，使压力表保持0.10～0.15的范围，维持一定灭菌时间，不同消毒物品所需时间不同，一般灭菌2030min。④放气取物。当灭菌到所需时间时，断开电源，让压力自然下降。当达到0.05MPa时可放出蒸气，至零时，打开锅取出物品。1LHAFAEL-81.外桶，2.锅盖，3.安全阀，4.排气阀，5.气压表，6.内桶7.排气软管，8.支架半自动立式灭菌器（1）构造：立式灭菌器主要由总阀、气压表、放气阀、丝杠扳手、紧定丝母、水碗、进水阀、水位线标志、排水阀、夹层压力表等零部件构成。（2）使用①加水：接通电源，检查水位，打开进水阀，向水碗注入清水直至水位到标志线为止，然后关闭进水阀：②移开上盖装入物品：顺时针方向旋动丝杠扳手使上盖离开上口后，推动横梁移开上盖，装入灭菌物品，注意留有空隙以利消毒彻底③关闭上盖：逆时针转动丝杠扳手直至紧到不能转为止；以下过程同便携式灭菌器
5 ①打开锅盖，加入清水，至接近帘子的程度，然后装入培养物，盖上盖，对角线拧紧丝母； ②接通电源，使灭菌器开始工作。当压力表指针升到 0．05MPa 时，打开放气阀放出冷气，直至 回零，关闭放气阀，使灭菌器继续工作。 ③当压力达到 0．10MPa 时，开始计算时间，使压力表保持 0．10～0．15 的范围， 维持一定灭菌时间，不同消毒物品所需时间不同，一般灭菌 20～30min。 ④放气取物。当灭菌到所需时间时，断开电源，让压力自然下降。当达到 0．05MPa 时可放出蒸气，至零时，打开锅取出物品。 1.外桶 ，2.锅盖，3.安全阀，4.排气阀，5.气压表，6.内桶， 7.排气软管，8.支架 半自动立式灭菌器 （l）构造：立式灭菌器主要由总阀、气压表、放气阀、丝杠扳手、紧定丝母、水碗、进水阀、 水位线标志、排水阀、夹层压力表等零部件构成。 （2）使用 ①加水：接通电源，检查水位，打开进水阀，向水碗注入清水直至水位到标志线为止，然后关 闭进水阀； ②移开上盖装入物品；顺时针方向旋动丝杠扳手使上盖离开上口后，推动横梁移开上盖，装入 灭菌物品，注意留有空隙以利消毒彻底； ③关闭上盖；逆时针转动丝杠扳手直至紧到不能转为止； ④以下过程同便携式灭菌器