简单介绍 1模板 PCR模板可以是DNA,也可以是RNA(需先经过反转录生成CDNA) 要求 纯化的模板,单链或双链,线性DNA,小片段(扩增效率髙),适宜模板 量(eg:哺乳动物基因组1μg,酵母10ng,细菌1ng,质粒基因组1g) 2引物 PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的→引物 的选择关系到PCR的特异性。通常体系中有一对引閣物,即5端引物和3端引 物。扩增时,5端引物与位于待增片段5′端上游的-小段DNA序列相同, 引导信息链的合成;3端引物与位于待增片段3端下游的一小段序列互补, 引导互补链的合成,PCR扩增产物为一对引物之间的双链DNA片段。 要求 高质量的引物且需要纯化,精心设计:长度、基本成分、引物自身、引物之 间、3ˆ未端、5朱未端、熔解温度、特异性、简并性等(计算机软件),用量 及计算(一般要求01~0.5mo) By Weining
11 By Weining 简单介绍： 1.模板 PCR模板可以是DNA，也可以是RNA（需先经过反转录生成cDNA） 要求： 纯化的模板，单链或双链，线性DNA，小片段（扩增效率高），适宜模板 量（eg：哺乳动物基因组1μg，酵母10ng，细菌1ng，质粒基因组1pg） 2.引物 PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的→引物 的选择关系到PCR的特异性。通常体系中有一对引物，即5’端引物和3’端引 物。扩增时，5’端引物与位于待增片段5’ 端上游的一小段DNA序列相同， 引导信息链的合成；3’端引物与位于待增片段3’端下游的一小段序列互补， 引导互补链的合成，PCR扩增产物为一对引物之间的双链DNA片段。 要求： 高质量的引物且需要纯化，精心设计：长度、基本成分、引物自身、引物之 间、3’末端、5’末端、熔解温度、特异性、简并性等（计算机软件），用量 及计算（一般要求0.1~0.5μmol）
简单介绍 3反应缓冲系统 提供PCR所必需的、合适的酸碱度和某些离子。 最常用:10~50mmol/ L Tris-HC|(pH8.3~8.8,20℃C),72℃C(通常 PCR延长阶段的温度)pH72;实际反应体系中,pH68~78 还含有KC|,50mmo/L以内有利于引物退火 还可加入Taq聚合酶保护剂 4.二价阳离子一一Mg2+ 所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子(通常是Mg2+),此外 №g2浓度影响引物退火、模板与PCR产物解链温度、产物特异性、引物二 聚体生成等(Mq2+总量应比dNTP浓度高0.2~2.5mmo/L) 5.三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 四种 dNTPs为PCR的合成原料。 在标准的PCR中各种dNTP的浓度应相等,若浓度有明显差异时,会诱发聚 合酶的错误掺入而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响PCR的速度和 特异性,应严格控制。 By Weining
12 By Weining 简单介绍： 3.反应缓冲系统 提供PCR所必需的、合适的酸碱度和某些离子。 最常用：10~50mmol/L Tris-HCl（pH8.3~8.8,20℃），72℃（通常 PCR延长阶段的温度）pH7.2；实际反应体系中，pH6.8~7.8 还含有KCl，50mmol/L以内有利于引物退火。 还可加入Taq聚合酶保护剂 4.二价阳离子——Mg2+ 所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子（通常是Mg2+），此外 Mg2+浓度影响引物退火、模板与PCR产物解链温度、产物特异性、引物二 聚体生成等（Mg2+总量应比dNTP浓度高0.2~2.5mmol/L） 5.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 四种dNTPs为PCR的合成原料。 在标准的PCR中各种dNTP的浓度应相等，若浓度有明显差异时，会诱发聚 合酶的错误掺入而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响PCR的速度和 特异性，应严格控制
简单介绍 6耐热DNA聚合酶 能经受95℃以上的高温而不失活,因而无需再每轮循环中添加新酶;同时 催化的聚合反应的最适温度为70~80°℃,此时引物与模板结合的特异性好, 故产物纯度高。 现已发现多种耐热DNA聚合酶,性能尚有差别。应用最多 Taq pol(Taq DNA聚合酶,台籍科学家钱嘉韵分离得到):高热稳定性、高催化活性、 忠实性、反转录活性、非模板依赖的聚合活性。 其他:修饰 Tag dNA聚合酶、 Th dna聚合酶、 Vent dna聚合酶Sac DNA聚合酶 PfU dna聚合酶 7.PCR促进剂 据报道通过系那个PCR体系中加入助溶剂和添加剂,可以降低碱基错配水平, 提高富含GC模板的扩增效率。 常见:DMSO、甘油、TMAC 大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR的反应起抑制作用 PCR理论与技术(第二版),2009 By Weining
13 By Weining 简单介绍： 6.耐热DNA聚合酶 能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需再每轮循环中添加新酶；同时 催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好， 故产物纯度高。 现已发现多种耐热DNA聚合酶，性能尚有差别。应用最多Taq pol（Taq DNA聚合酶，台籍科学家钱嘉韵分离得到）：高热稳定性、高催化活性、 忠实性、反转录活性、非模板依赖的聚合活性。 其他：修饰Taq DNA聚合酶、Th DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶 Sac DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 7.PCR促进剂 据报道通过系那个PCR体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平， 提高富含GC模板的扩增效率。 常见：DMSO、甘油、TMAC 大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR的反应起抑制作用 PCR理论与技术（第二版），2009
操作步骤 1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5m离心管中。 10× Pcr buffer 5μl dNTP mⅸ(2mM) 4 ul 引物1(10pM) 2μl 引物2(10pM) 2 ul Taq酶(2U/μu) 1μul DNA模板(50ng-1ug/ul)1ul 加ddH2O至 dH2O蒸馏水;dH2O重蒸水,即经过两次蒸馏的水,一般 视PCR仪有无热盖, 应用于比较精密的实验,如分子生物学实验中试剂的配制 JJH-IsJH 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩 增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃C405→ 58℃305→72C60s,循环30-35次,最后在72°C保温7min 3.结束反应,PCR产物放置于4C待电泳检测或20°长期保存。 4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μ氯仿进行抽 提反应混台液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μ电泳检测。 By Weining
14 By Weining 操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩 增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。 3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽 提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。 dH2O 蒸馏水；ddH2O 重蒸水，即经过两次蒸馏的水，一般 应用于比较精密的实验，如分子生物学实验中试剂的配制
PCR反应条件 PCR的基本原理 PB过程 ·POR的特点 94高温变性低温退火适温延伸 重复13步 温 2530轮 度 (C) 目的DNA片段 55 形成条单链 子链延伸 扩增100万倍以上 性 DNA加倍 DNA单链 22 与引物复性 DNA双螺旋 时间(min) By Weining
15 By Weining PCR的基本原理 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温 度 （℃） • PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA 变 性 形 成 2 条 单 链 子链延伸 DNA加倍