抗原抗体检测技术 抗原与相应的抗体在体外相遇时可发生特异性结合，呈现某种反应现象。根据抗原的物 理性状及参与反应的物质不同可以分为凝集反应、沉淀反应及补体参与的各种反应等。 一、直接凝巢 在玻片或其它支持物上，颗粒性抗原（细胞、细南等）与相应抗体在有适量电解质存在 时，直接结合可形成肉眼可见的凝集块。该方法简便，快速，为定性试验，常用于鉴定抗原 (一)玻片凝集-AB0血型鉴定 根据人红细胞表面ABO血型抗原和人血清中ABO抗体，可将人血型分为A型、B型、 O型和AB型。A型：有A抗原，抗B抗体：B型：有B抗原，抗A抗体：AB型：有A 和B抗原，无抗A抗B抗体；O型：无A和B抗原，有抗A和抗B抗体。检测红细胞表 面AB0血型抗原，标本为红细胞，称为正定型。检测人血清中抗A、B抗体，标本为血清， 称为反定型。 1、正定型 (①材料： ①红细胞标本：采静脉血。 ②抗体试剂：抗A、抗B血型抗原单克隆抗体（血凝效价256，亲合性少于15秒）。 ③生理盐水。 ④器材：玻片、小试管、小巴氏管、小吸球、无茵注射器、止血带、牙签、记号笔、酒 精棉球、碘酒棉球等。 (②方法： ①取一块玻片或瓷砖片，按下表标记划格，每块板可以检测5人。 红细胞标本 试剂 2 3 抗A抗体 抗B抗体 抗原型别
抗原抗体检测技术 抗原与相应的抗体在体外相遇时可发生特异性结合，呈现某种反应现象。根据抗原的物 理性状及参与反应的物质不同可以分为凝集反应、沉淀反应及补体参与的各种反应等。 一、直接凝集 在玻片或其它支持物上，颗粒性抗原（细胞、细菌等）与相应抗体在有适量电解质存在 时，直接结合可形成肉眼可见的凝集块。该方法简便，快速，为定性试验，常用于鉴定抗原。 （一）玻片凝集-ABO 血型鉴定 根据人红细胞表面 ABO 血型抗原和人血清中 ABO 抗体，可将人血型分为 A 型、B 型、 O 型和 AB 型。A 型：有 A 抗原，抗 B 抗体；B 型：有 B 抗原，抗 A 抗体；AB 型：有 A 和 B 抗原，无抗 A 抗 B 抗体；O 型：无 A 和 B 抗原，有抗 A 和抗 B 抗体。检测红细胞表 面 ABO 血型抗原，标本为红细胞，称为正定型。检测人血清中抗 A 、B 抗体，标本为血清， 称为反定型。 1、正定型 ⑴材料： ①红细胞标本：采静脉血。 ②抗体试剂：抗 A、抗 B 血型抗原单克隆抗体（血凝效价 256，亲合性少于 15 秒）。 ③生理盐水。 ④器材：玻片、小试管、小巴氏管、小吸球、无菌注射器、止血带、牙签、记号笔、酒 精棉球、碘酒棉球等。 ⑵方法： ①取一块玻片或瓷砖片，按下表标记划格，每块板可以检测 5 人。 红细胞标本 试 剂 1 2 3 4 5 抗 A 抗体 抗 B 抗体 抗原型别
②取试管，装入1ml生理盐水。皮肤消毒后，静脉抽血1ml,滴2滴入试管中（余下 静置，留取血清，做反定型用)，混匀。 ③取盐水稀释后的血液滴在玻片的相应上下格中，各1滴。 ④滴抗A、抗B单克隆抗体试剂各一滴于相应的上下格中，立即用牙签搅匀红细胞及 抗体。搅抗A和抗B格时要用牙签的不同端。 ⑤5秒钟内就可形成凝集物。要在3分钟内观察结果并记录。出现凝集的记十，无凝集 的记一，出现凝集的即为该标木所有的ABO血型抗原。 2、反定型 ()材料： ①红细胞试剂：AB0同型血2~3人份混合，生理盐水洗涤3遍后，制备成2%红细胞 生理盐水悬液。 ②被检血清标本：见正定型方法2。 ③用正定型材料(3)和(4)。 (2方法： ①玻片或瓷砖片，按下表标记划格。 血清标本 红细胞 A型 B型 抗体型别 ②取血清标本分别滴入上下相应2个格中，各1滴。 ③分别滴A和B型红细胞于相应格中。 ④立即用牙签搅匀血清和红细胞。用牙签的不同端搅匀A和B红细胞。 ⑤3分钟内观察结果，出现凝集的记为十，无凝集的记为一，出现凝集者即为血清中含 有的ABO抗体。 3、试验结果判定： 红细胞标本 1 2 3 4
②取试管，装入 1 ml 生理盐水。皮肤消毒后，静脉抽血 1ml，滴 2 滴入试管中（余下 静置，留取血清，做反定型用），混匀。 ③取盐水稀释后的血液滴在玻片的相应上下格中，各 1 滴。 ④滴抗 A、抗 B 单克隆抗体试剂各一滴于相应的上下格中，立即用牙签搅匀红细胞及 抗体。搅抗 A 和抗 B 格时要用牙签的不同端。 ⑤5 秒钟内就可形成凝集物。要在 3 分钟内观察结果并记录。出现凝集的记＋，无凝集 的记－，出现凝集的即为该标本所有的 ABO 血型抗原。 2、反定型 ⑴材料： ①红细胞试剂：ABO 同型血 2～3 人份混合，生理盐水洗涤 3 遍后，制备成 2%红细胞 生理盐水悬液。 ②被检血清标本：见正定型方法 2。 ③用正定型材料（3）和（4）。 ⑵方法： ①玻片或瓷砖片，按下表标记划格。 血清标本 红细胞 1 2 3 4 5 A 型 B 型 抗体型别 ②取血清标本分别滴入上下相应 2 个格中，各 1 滴。 ③分别滴 A 和 B 型红细胞于相应格中。 ④立即用牙签搅匀血清和红细胞。用牙签的不同端搅匀 A 和 B 红细胞。 ⑤3 分钟内观察结果，出现凝集的记为＋，无凝集的记为－，出现凝集者即为血清中含 有的 ABO 抗体。 3、试验结果判定： 红 细 胞 标 本 1 2 3 4
抗A 十 抗B 血清标本 A细胞 一 + B细胞 + + 血型 A B 0 AB (二)试管凝集 原理： 在试管中，颗粒性抗原（细胞、细菌等）与相应抗体在有适量电解质存在时，直接结合 可形成肉眼可见的凝集块。 应用： (1)用己知的病原菌为抗原，与病人血清作定量细茵凝集试验，辅助诊断某些疾病，如： 诊断伤寒、副伤寒病的肥大氏反应(Widal test),诊断斑疹伤寒的外-裴氏反应(Weil-Felixtest)。 (②)用红细胞凝集试验测定免疫溶血性疾病等人体内血型抗体的效价 (3)鉴定人ABO血型单克隆抗体试剂的效价，要求ABO血型抗A抗B单克隆抗体试剂 凝集效价≥256。 1、血型抗体凝集效价测定 (材料： ①人A型、B型红细胞悬液（一周内采集，无溶血）。 ②单克隆抗体试剂：抗A、抗B单克隆抗体各一支。 ③生理盐水、小试管、吸球、吸管、试管架等。 (②方法： ①取小试管10支，编号，置试管架上。 ②用1ml吸管吸生理盐水0.9ml于第一管中，其余管中加入生理盐水0.5ml ③用1ml吸管吸抗A或抗B试剂0.1ml于第一管中，反复吹吸三次，防止起气泡，混 匀后吸出0.5ml注入第二管，同样混匀后吸出0.5ml注入第三管中，以此类推，稀释至第 九管，第九管混匀后弃去0.5ml,第十管不加抗体试剂。 ④每管中加入2%A型或B型红细胞悬液各0.5ml
抗 A ＋ － － ＋ 抗 B － ＋ － ＋ 血 清 标 本 A 细胞 － ＋ ＋ － B 细胞 ＋ － ＋ － 血 型 A B O AB （二）试管凝集 原理： 在试管中，颗粒性抗原（细胞、细菌等）与相应抗体在有适量电解质存在时，直接结合 可形成肉眼可见的凝集块。 应用： ⑴用已知的病原菌为抗原，与病人血清作定量细菌凝集试验，辅助诊断某些疾病，如： 诊断伤寒、副伤寒病的肥大氏反应（Widal test）,诊断斑疹伤寒的外-裴氏反应（Weil-Felix test）。 ⑵用红细胞凝集试验测定免疫溶血性疾病等人体内血型抗体的效价 ⑶鉴定人 ABO 血型单克隆抗体试剂的效价，要求 ABO 血型抗 A 抗 B 单克隆抗体试剂 凝集效价≥ 256。 1、血型抗体凝集效价测定 ⑴材料： ①人 A 型、B 型红细胞悬液（一周内采集，无溶血）。 ②单克隆抗体试剂：抗 A、抗 B 单克隆抗体各一支。 ③生理盐水、小试管、吸球、吸管、试管架等。 ⑵方法： ①取小试管 10 支，编号，置试管架上。 ②用 1ml 吸管吸生理盐水 0.9 ml 于第一管中，其余管中加入生理盐水 0.5 ml. ③用 1 ml 吸管吸抗 A 或抗 B 试剂 0.1 ml 于第一管中，反复吹吸三次，防止起气泡，混 匀后吸出 0.5 ml 注入第二管，同样混匀后吸出 0.5 ml 注入第三管中，以此类推，稀释至第 九管，第九管混匀后弃去 0.5 ml，第十管不加抗体试剂。 ④每管中加入 2%A 型或 B 型红细胞悬液各 0.5 ml
⑤混匀后，37℃放置2小时以上，观察结果。 试管凝集操作及结果举例 试管号 12345678910 生理盐水ml 0.910.510.510.510.510.510.510.510.50.5 0.10.5下0.50.5下0.50.50.50.50.5弃 抗体（血清）ml 抗原（红细胞）ml0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5 血清稀释度20 4080160320640128025605120 37℃放置2小时以上 结果举例4+4+4+3+3+2+2+1+ (3)结果判定： ①第十管为阴性对照，应无凝集现象。 ②凝集程度以4十、3十、2+、1+、±、一表示。 4+:血球全部凝集，成1至2块，上清澄清。晃动时，凝集物成片状分散。 3十：血球绝大部分凝集，成大块拌数小块，或数个小块，上清较澄清。 2+：血球约半数凝集，成清楚的小凝块。上清略澄清。 1十：血球少数凝集，成肉眼可确定的小凝块。 士：血球很少数凝集，肉眼难判定，光镜下可见凝块。 一：无凝集，血球沉淀成边界清楚的圆点，晁动时，分散均匀。 ③血型抗体凝集效价判定：以肉眼可见凝集(1十)的血型试剂最高稀释倍数为该试剂 凝集效价。表中列举的血型试剂效价为2560。 二、间接凝集抗链球菌溶血素0抗体的检测 将小分子可溶性抗原（激素、细菌及寄生虫提取物等）吸附到一种与免疫无关的颗粒 性载体（红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等）表面，再与相应抗体结合，能出现肉眼可见 的凝集物。因载体的不同，又分别称为间接血凝，间接乳凝，间接炭凝等。 间接凝集具有快速、简便、微量等特点，敏感性比直接凝集高2一8倍，可用于检测微 量抗原或抗体，如用于梅毒螺旋体、类风湿因子、乙肝表面抗原、抗链球菌溶血素O等的 检测。 血清中AS0的测定可用于诊断链球菌感染。链球菌感染病人的血清中含有高滴度的 ASO,此血清中加入适量的溶血素后，可中和掉正常水平的ASO,多余的AS0可与ASO
⑤混匀后，37℃放置 2 小时以上，观察结果。 试管凝集操作及结果举例 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理盐水 ml 抗体(血清) ml 抗原(红细胞)ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 血清稀释度 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 37℃放置 2 小时以上 结果举例 4＋ 4＋ 4＋ 3＋ 3＋ 2＋ 2＋ 1＋ ± － ⑶结果判定： ①第十管为阴性对照，应无凝集现象。 ②凝集程度以 4＋、3＋、2＋、1＋、±、－表示。 4＋：血球全部凝集，成 1 至 2 块，上清澄清。晃动时，凝集物成片状分散。 3＋：血球绝大部分凝集，成大块拌数小块，或数个小块，上清较澄清。 2＋：血球约半数凝集，成清楚的小凝块。上清略澄清。 1＋：血球少数凝集，成肉眼可确定的小凝块。 ± ：血球很少数凝集，肉眼难判定，光镜下可见凝块。 － ：无凝集，血球沉淀成边界清楚的圆点，晃动时，分散均匀。 ③血型抗体凝集效价判定：以肉眼可见凝集（1＋）的血型试剂最高稀释倍数为该试剂 凝集效价。表中列举的血型试剂效价为 2560。 二、间接凝集-抗链球菌溶血素 O 抗体的检测 将小分子可溶性抗原（激素、细菌及寄生虫提取物等）吸附到一种与免疫无关的颗粒 性载体（红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等）表面，再与相应抗体结合，能出现肉眼可见 的凝集物。因载体的不同，又分别称为间接血凝，间接乳凝，间接炭凝等。 间接凝集具有快速、简便、微量等特点，敏感性比直接凝集高 2～8 倍，可用于检测微 量抗原或抗体，如用于梅毒螺旋体、类风湿因子、乙肝表面抗原、抗链球菌溶血素 O 等的 检测。 血清中 ASO 的测定可用于诊断链球菌感染。链球菌感染病人的血清中含有高滴度的 ASO，此血清中加入适量的溶血素后，可中和掉正常水平的 ASO，多余的 ASO 可与 ASO
乳胶试剂反应，出现凝集物。ASO乳胶试剂系羧化聚苯乙烯乳胶与溶血素O共价交联的产 物。 1、材料： (1)溶血素0溶液，用时摇匀。 (②ASO乳胶试剂，用时摇匀。 (3)病人血清、阳性及阴性对照血清。 ④微量反应板、加样器、吸头等。 2、方法 ()血清标本用生理盐水1：15稀释，56℃灭活30分钟以灭活补体. (2)在微量反应板各孔里分别加入50如稀释灭活血清以及阳性和阴性对照血清，每孔再 分别加入50如l溶血素0，轻轻摇动1分钟，使其充分混匀。 (3)每孔加入50ulAS0乳胶试剂，室温下(18℃~20C)轻轻摇动3分钟，将微量反应 板平放在实验桌上，出现清晰凝集物者为阳性，不出现凝集物者为阴性，阴性者的 ASOs2501U/ml. (④)阳性者的血清进一步稀释为1：30和1：60，再重复步骤2和3，出现凝集的血清稀 释度和ASO滴度间的关系大致如下： 稀释度 1:15 1:30 1:60 ASO IU/ml 400 800 1600 3、注意事项： ()SO乳胶加入后，轻轻摇动到三分钟时应立即记录结果，超过规定时间后再出现凝 集者不记为阳性。 (②)室温降低10℃，在乳胶试剂加入后应延长反应时间1分钟，室温升高10℃，应缩短 反应时间1分钟。 (3)溶血、脂血症、高胆红素血症、高胆固醇血症、类风湿因子阳性以及标本被细菌轻度 污染都不会影响本试验的结果。 (4)乳胶试剂不可冰冻，放置在4℃冰箱保存，有效期可达一年，用前摇匀。 三、协同凝集 原理：
乳胶试剂反应，出现凝集物。ASO 乳胶试剂系羧化聚苯乙烯乳胶与溶血素 O 共价交联的产 物。 1、材料： ⑴溶血素 O 溶液，用时摇匀。 ⑵ASO 乳胶试剂，用时摇匀。 ⑶病人血清、阳性及阴性对照血清。 ⑷微量反应板、加样器、吸头等。 2、方法： ⑴血清标本用生理盐水 1 15 ∶ 稀释，56℃灭活 30 分钟以灭活补体。 ⑵在微量反应板各孔里分别加入 50μl 稀释灭活血清以及阳性和阴性对照血清，每孔再 分别加入 50μl 溶血素 O，轻轻摇动 1 分钟，使其充分混匀。 ⑶每孔加入 50μl ASO 乳胶试剂，室温下（18℃～20℃）轻轻摇动 3 分钟，将微量反应 板平放在实验桌上，出现清晰凝集物者为阳性，不出现凝集物者为阴性，阴性者的 ASO≤250IU/ml。 ⑷阳性者的血清进一步稀释为 1 30 ∶ 和 1 60 ∶ ，再重复步骤 2 和 3，出现凝集的血清稀 释度和 ASO 滴度间的关系大致如下： 稀释度 1 15 ∶ 1 30 ∶ 1 60 ∶ ASO IU/ml 400 800 1600 3、注意事项： ⑴ASO 乳胶加入后，轻轻摇动到三分钟时应立即记录结果，超过规定时间后再出现凝 集者不记为阳性。 ⑵室温降低 10℃，在乳胶试剂加入后应延长反应时间 1 分钟，室温升高 10℃，应缩短 反应时间 1 分钟。 ⑶溶血、脂血症、高胆红素血症、高胆固醇血症、类风湿因子阳性以及标本被细菌轻度 污染都不会影响本试验的结果。 ⑷乳胶试剂不可冰冻，放置在 4℃冰箱保存，有效期可达一年，用前摇匀。 三、协同凝集 原理：