显微镜技术 显微镜是用米观察、记录和研究经过制片技术处理后被检物体细微结构的最主要的光学 精密仪器。它广泛地应用于各学科的领域中。这对微观世界的探索及理论的研究起着极其重 要的作用。 显微镜的种类繁多，不仅因制造年代和不同国家的产品有不同类型，而且在结构造型及 功能等方面亦各异。一般的，根据照明光源的性质米分可分为“光学显微镜"和“非光学显微 镜”。光学显微镜是利用人眼可见的可见光或紫外线作为光源的，它分为单式显微镜和复式 显微镜。其中单式显微镜制造简单，放大幸及性能均不高，它是由一块或几块透镜组成，如： 放大镜、平台解剖镜：而复式显微镜则是由多组透镜组合而成，并可根据结构、原理和应用 范围的不同分多种类型，如：常规普通复式显微镜、专用或多用特种显微镜（荧光和倒置显 微镜)及大型多用途的万能显微镜。非光学显微镜不是利用人眼可见的可见光或紫外线作为 光源的，而是利用电子束作为光源并且是以“电破透镜“作透镜的，因而也称电子显微镜。 一、光学显微镜 光学显微镜((light microscope)简称显微镜或光镜，是利用光线照明使微小物体形成放 大影像的仪器。目前使用最广泛的是普通光学显微镜，此外还有相差显微镜、暗视野显微镜 荧光显微镜和倒置显微镜等。 (一)普通光学显微镜 1、原理 普通光学显微镜的基木工作原理是利用物镜和目镜的多组凸透镜将物像逐级放大并反 射到视网膜上的过程。（如图1-1）。而显微镜性能和质量的高低可通过分辨率、数值孔径、 放大率及焦点深度、视场直径等指标来反映。 分辨率(resolving power)即显微镜的分辨本领，是指显微镜或人眼在25cm和明视距 离（能看清物像的最佳标准距离）处所能清楚分辨被检物体最小间隔的能力。它主要由物镜 的分辨率所决定而与目镜无关。具体公式如下： R0.61n. 0.61 NA nSina/2 其中入为照明光源的波长，如白光0.5μm。n为介质的折射率，如空气=l,玻璃=1.52
显微镜技术 显微镜是用来观察、记录和研究经过制片技术处理后被检物体细微结构的最主要的光学 精密仪器。它广泛地应用于各学科的领域中。这对微观世界的探索及理论的研究起着极其重 要的作用。 显微镜的种类繁多，不仅因制造年代和不同国家的产品有不同类型，而且在结构造型及 功能等方面亦各异。一般的，根据照明光源的性质来分可分为“光学显微镜”和“非光学显微 镜”。光学显微镜是利用人眼可见的可见光或紫外线作为光源的，它分为单式显微镜和复式 显微镜。其中单式显微镜制造简单，放大率及性能均不高，它是由一块或几块透镜组成，如： 放大镜、平台解剖镜；而复式显微镜则是由多组透镜组合而成，并可根据结构、原理和应用 范围的不同分多种类型，如：常规普通复式显微镜、专用或多用特种显微镜（荧光和倒置显 微镜）及大型多用途的万能显微镜。非光学显微镜不是利用人眼可见的可见光或紫外线作为 光源的，而是利用电子束作为光源并且是以“电磁透镜”作透镜的，因而也称电子显微镜。 一、光学显微镜 光学显微镜（light microscope）简称显微镜或光镜，是利用光线照明使微小物体形成放 大影像的仪器。目前使用最广泛的是普通光学显微镜，此外还有相差显微镜、暗视野显微镜、 荧光显微镜和倒置显微镜等。 （一）普通光学显微镜 1、原理 普通光学显微镜的基本工作原理是利用物镜和目镜的多组凸透镜将物像逐级放大并反 射到视网膜上的过程。（如图 1-1）。而显微镜性能和质量的高低可通过分辨率、数值孔径、 放大率及焦点深度、视场直径等指标来反映。 分辨率（resolving power）即显微镜的分辨本领，是指显微镜或人眼在 25cm 和明视距 离（能看清物像的最佳标准距离）处所能清楚分辨被检物体最小间隔的能力。它主要由物镜 的分辨率所决定而与目镜无关。具体公式如下： R 0.61λ 0.61λ = N·A = n·Sinα／2 其中 λ 为照明光源的波长，如白光 λ≈0.5μm。n 为介质的折射率，如空气 n=1，玻璃=1.52
香柏油=1.51，石蜡油=1.46。α为镜口角，它是指在工作距离处位于物镜光抽上标本中的 个点所发出的光线到物镜的前透镜有效直径两端所形成的夹角（图1-2）。可见通过降低波 长、增大介质折射率和加大孔径角及增加明暗反差是提高分辩率的有效手段。 数值f孔径(numerical aperture,NA.)也称镜口率，是直接决定显微镜分辨率的一个重要 参数，其公式为：NA=n-Sina/2,其中镜口率数字越大，表示分辨力越高。 放大率(minifying power)即放大倍数，是光镜性能的另一重要参数。它主要有4×、l0x、 40×和100×四种，其中4×和10×为低倍镜，40×为高倍镜，100x为油镜。另外，镜头长度随 倍数的增加依次增长，而在不同放大倍数的物镜筒上还标有不同颜色的环，以用于区别。 低倍镜、高倍镜以空气为介质，而油镜需以香柏油或石蜡油为介质。这样就避免了由于 油镜镜孔小，而使进入物镜的光线产生折射，从而导致视野暗淡，物像不清现象的发生。一 台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积，如目镜10x,物镜为40× 其放大倍数为10×40=400倍。常用显微镜的最大放大倍数为1600×。物镜和目镜的放大倍 数可用下列公式计算： 镜筒长度(110mm) 明视距离(250mm) 物镜放大倍数= :目镜放大倍数= 物镜焦距 目镜焦距 焦点深度(focal depth)即当显微镜对标本的某一点或平面准焦时，焦点平面上下影像 清晰的距离或范用。一般的焦点深度越大可看到被检物体的全层：反之，则只能看到被检物 体的一薄层。公式为 kn D=- MNA 其中，K=240um,n=介质折射率，M=总放大率，NA=数值孔径。 视场直径(Viewing field)也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场 内所能容纳被检物体的实际范围，其中视场直径愈大，愈便于观察。 2、显微镜的结构 显微镜(Microscope)的主要结构是由三部分组成，即：机械部分、照明部分和光学部 分（图1-3）。 ①机械部分 它是显微镜的支架结构，主要包括镜座、镜柱、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台和调 节器
香柏油=1.51，石蜡油=1.46。α 为镜口角，它是指在工作距离处位于物镜光轴上标本中的一 个点所发出的光线到物镜的前透镜有效直径两端所形成的夹角（图 1-2）。可见通过降低波 长、增大介质折射率和加大孔径角及增加明暗反差是提高分辩率的有效手段。 数值孔径（numerical aperture , NA.）也称镜口率，是直接决定显微镜分辨率的一个重要 参数，其公式为：N·A＝n·Sinα/2，其中镜口率数字越大，表示分辨力越高。 放大率（minifying power）即放大倍数，是光镜性能的另一重要参数。它主要有 4×、10×、 40×和 100×四种，其中 4×和 10×为低倍镜，40×为高倍镜，100×为油镜。另外，镜头长度随 倍数的增加依次增长，而在不同放大倍数的物镜筒上还标有不同颜色的环，以用于区别。 低倍镜、高倍镜以空气为介质，而油镜需以香柏油或石蜡油为介质。这样就避免了由于 油镜镜孔小，而使进入物镜的光线产生折射，从而导致视野暗淡，物像不清现象的发生。一 台显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积，如目镜 10×，物镜为 40×， 其放大倍数为 10×40＝400 倍。常用显微镜的最大放大倍数为 1600×。物镜和目镜的放大倍 数可用下列公式计算： 镜筒长度(110mm) 明视距离（250mm） 物镜放大倍数= 物镜焦距 ;目镜放大倍数= 目镜焦距 焦点深度（focal depth）即当显微镜对标本的某一点或平面准焦时，焦点平面上下影像 清晰的距离或范围。一般的焦点深度越大可看到被检物体的全层；反之，则只能看到被检物 体的一薄层。公式为： k·n D = M·NA 其中，K＝240μm，n＝介质折射率，M＝总放大率，NA＝数值孔径。 视场直径（Viewing field）也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场 内所能容纳被检物体的实际范围，其中视场直径愈大，愈便于观察。 2、显微镜的结构 显微镜（Microscope）的主要结构是由三部分组成，即：机械部分、照明部分和光学部 分（图 1－3）。 ①机械部分 它是显微镜的支架结构，主要包括镜座、镜柱、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台和调 节器
1)镜座(bos):它是显微镜的基座，用以支持整个镜体的平稳。它常呈马蹄铁形、圆 形或方形，有的显微镜在镜座内装有照明光源。 2)镜柱(p0s):它是镜座向上直立的短柱，它常与镜座和镜臂相连，也具有支持作用。 3)镜臂(am):它是与镜柱相连的结构，适于手握。有的显微镜（如：L1100型）的镜 柱和镜臂合起来统称为主体。 4)镜筒(tube):它是附在镜臂前方的筒状结构，由金属制成，其上端装有目镜，下端 装有物镜转换器。目前可根据镜筒数目，将光镜分为单筒式和双筒式两种。 5)物镜转换器(revolving nose-piece):它常装在镜简的下端，呈圆盘状，分上下两片。 上片固定在镜筒下端，其正后方有一固定卡：下片可自由转动，并且有3一4个螺旋孔，用 以安装不同倍数的物镜。螺旋孔外缘处各有一个缺刻，当转换物镜时，下片的缺刻与上片的 固定卡相扣合，此时物镜和镜筒同轴，便于观察。 6)载物台(stag©)：它是位于物镜转换器下方一个方形平台，用于放置玻片标本。台面 水平并与显微镜的光轴垂直，在台面的中央有一圆孔称通光孔，是用来通透光线的。载物台 上装有推进器，其左侧附有镶刀形的弹簧卡，用来夹持玻片标本：右侧有两个螺旋，扭动螺 旋可使标本前后左右移动，利于观察标本。此外推进器上还有标尺，可用来确定标本在视野 的位置。 7)调节器(focusing adjustment):它是装在主体上的螺旋状结构，分大小两个螺旋，呈 套叠状。转动大螺旋（粗调节器）可使载物台快速和大幅度升降，从而将物像迅速收入视野 通常在低倍镜下寻找物像时使用：转动小螺旋（细调节器），可使载物台缓慢地升降，不易 觉察，多在高倍镜或油镜下调焦时使用，以获得清渐图像。 ②照明部分 在载物台的下方装有一套照明装置，它由集光器、滤光器和反光镜或电光源组成。 1)集光器(condenser):也称聚光器，它位于载物台的下方，由聚光镜和光圈组成，其 作用是把光线集中到所要观察的标本上。在其左侧有一调节螺旋，可使集光器上升或下降， 上升时可使视野亮度增强，下降时可使视野亮度减弱。 a.聚光镜：是由一片或数片透镜组成，其作用相当于一凸透镜，可把光线进一步集中在 标本上，以增加标本的亮度。 b.光圈：又称可变光阑或孔径光阑，位于聚光镜的下端由十几张金属簿片围成，中间有 圆孔，光圈的外侧有一小柄，推动小柄可调节光圈孔径的大小，以改变视野的亮度， 2)滤光器(ft©r):它常安装在光圈下方，由滤光片和滤光架构成，其作用是在观察标
1)镜座（bose）：它是显微镜的基座，用以支持整个镜体的平稳。它常呈马蹄铁形、圆 形或方形，有的显微镜在镜座内装有照明光源。 2)镜柱（post）：它是镜座向上直立的短柱，它常与镜座和镜臂相连，也具有支持作用。 3)镜臂（arm）：它是与镜柱相连的结构，适于手握。有的显微镜（如：L1100 型）的镜 柱和镜臂合起来统称为主体。 4）镜筒（tube）：它是附在镜臂前方的筒状结构，由金属制成，其上端装有目镜，下端 装有物镜转换器。目前可根据镜筒数目，将光镜分为单筒式和双筒式两种。 5)物镜转换器（revolving nose-piece）：它常装在镜筒的下端，呈圆盘状，分上下两片。 上片固定在镜筒下端，其正后方有一固定卡；下片可自由转动，并且有 3～4 个螺旋孔，用 以安装不同倍数的物镜。螺旋孔外缘处各有一个缺刻，当转换物镜时，下片的缺刻与上片的 固定卡相扣合，此时物镜和镜筒同轴，便于观察。 6)载物台（stage）：它是位于物镜转换器下方一个方形平台，用于放置玻片标本。台面 水平并与显微镜的光轴垂直，在台面的中央有一圆孔称通光孔，是用来通透光线的。载物台 上装有推进器，其左侧附有镰刀形的弹簧卡，用来夹持玻片标本；右侧有两个螺旋，扭动螺 旋可使标本前后左右移动，利于观察标本。此外推进器上还有标尺，可用来确定标本在视野 的位置。 7)调节器（focusing adjustment）：它是装在主体上的螺旋状结构，分大小两个螺旋，呈 套叠状。转动大螺旋（粗调节器）可使载物台快速和大幅度升降，从而将物像迅速收入视野， 通常在低倍镜下寻找物像时使用；转动小螺旋（细调节器），可使载物台缓慢地升降，不易 觉察，多在高倍镜或油镜下调焦时使用，以获得清晰图像。 ②照明部分 在载物台的下方装有一套照明装置，它由集光器、滤光器和反光镜或电光源组成。 1)集光器（condenser）：也称聚光器，它位于载物台的下方，由聚光镜和光圈组成，其 作用是把光线集中到所要观察的标本上。在其左侧有一调节螺旋，可使集光器上升或下降， 上升时可使视野亮度增强，下降时可使视野亮度减弱。 a.聚光镜：是由一片或数片透镜组成，其作用相当于一凸透镜，可把光线进一步集中在 标本上，以增加标本的亮度。 b.光圈：又称可变光阑或孔径光阑，位于聚光镜的下端由十几张金属薄片围成，中间有 圆孔，光圈的外侧有一小柄，推动小柄可调节光圈孔径的大小，以改变视野的亮度。 2)滤光器（filter）：它常安装在光圈下方，由滤光片和滤光架构成，其作用是在观察标
本和显微摄影时，选择某一波段的光线，而排除不需要的光线。 3)反光镜(eflection mirror):它位于集光器下方，常与镜柱相连，可随意转动，其作用 是改变光线的方向和调整光线的强弱。它由两面构成：一面平展，一面凹陷。当光强时，用 平面镜：而当光弱时，则用凹面镜。在电光源显微镜中，光线可通过镜座中装有的反射镜或 反射棱镜反射到集光器中。 4)光源(Iigt):显微镜的光源有自然光源和电光源两种。自然光源是由太阳折射所发 出的光：而电光源则是由日光灯或白炽灯等所发出的光，其作用是为显微镜提供光线。 ③光学部分 它是显微镜的最重要部分，主要由目镜和物镜构成。 1)镜(ocular):也称接目镜，它位于镜筒的最上端，其上标有放大倍数。一般说来， 每台显微镜都配有2一3个目镜，用于观察不同放大倍数的需要。在目镜内常装有一指针， 用以标示标本的位置，另外在目镜筒下方还有一挡片是用于安装目镜测微尺的。 2)镜(objective℃)：又称接物镜，它常装在镜筒下端与物镜转换器的螺旋孔相连，一般 有3一4个。在镜筒侧面常标有主要性能指标，如放大倍数、镜口率、镜筒长度和所需要盖 片厚度。常用显微镜物镜的表示方法如图1-4。其中10、40、100表示放大倍数，0.25、0.65、 125表示镜口率，160表示镜筒长度，0.17表示盖片厚度，单位为毫米。镜筒长度是指从目 镜筒上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离。另外，工作距离是指在观察标本，并把物像调到 最清晰的程度时，物镜下表面与盖片之间的距离。物镜的放大倍数越大，其工作距离越小。 (二)显微镜的使用方法 1、低倍镜的使用方法 ()准备： 1、右手握镜臂，左手托镜座，将显微镜从镜箱中取出，镜筒朝前放在自己座位前方偏 左的实验台上，使镜座后缘距台边6-7cm。 2、适当调整座位的高度，使操作者能舒适坐者进行操作。 3、检查显微镜的各个部件是否完整和正常。 4、向内转动粗调节器，使载物台略为上升，再转动转换器，让转换器边缘的缺刻与固 定卡相扣合，以使低倍镜的光轴对准镜筒中心和通光孔。 5、打开光圈，上升集光器。 (②对光：从目镜观察，同时两手转动反光镜，使镜面正对光源，直到镜内出现均匀且亮 度适中的圆形亮光，这个发亮的范围称为视野
本和显微摄影时，选择某一波段的光线，而排除不需要的光线。 3)反光镜（eflection mirror）：它位于集光器下方，常与镜柱相连，可随意转动，其作用 是改变光线的方向和调整光线的强弱。它由两面构成：一面平展，一面凹陷。当光强时，用 平面镜；而当光弱时，则用凹面镜。在电光源显微镜中，光线可通过镜座中装有的反射镜或 反射棱镜反射到集光器中。 4)光源（light）：显微镜的光源有自然光源和电光源两种。自然光源是由太阳折射所发 出的光；而电光源则是由日光灯或白炽灯等所发出的光，其作用是为显微镜提供光线。 ③光学部分 它是显微镜的最重要部分，主要由目镜和物镜构成。 1）镜（ocular）：也称接目镜，它位于镜筒的最上端，其上标有放大倍数。一般说来， 每台显微镜都配有 2－3 个目镜，用于观察不同放大倍数的需要。在目镜内常装有一指针， 用以标示标本的位置，另外在目镜筒下方还有一挡片是用于安装目镜测微尺的。 2）镜（objective）：又称接物镜，它常装在镜筒下端与物镜转换器的螺旋孔相连，一般 有 3－4 个。在镜筒侧面常标有主要性能指标，如放大倍数、镜口率、镜筒长度和所需要盖 片厚度。常用显微镜物镜的表示方法如图 1-4。其中 10、40、100 表示放大倍数，0.25、0.65、 1.25 表示镜口率，160 表示镜筒长度，0.17 表示盖片厚度，单位为毫米。镜筒长度是指从目 镜筒上缘到物镜转换器螺旋口下端的距离。另外，工作距离是指在观察标本，并把物像调到 最清晰的程度时，物镜下表面与盖片之间的距离。物镜的放大倍数越大，其工作距离越小。 （二）显微镜的使用方法 1、低倍镜的使用方法 ⑴ 准备： 1、右手握镜臂，左手托镜座，将显微镜从镜箱中取出，镜筒朝前放在自己座位前方偏 左的实验台上，使镜座后缘距台边 6－7cm。 2、适当调整座位的高度，使操作者能舒适坐着进行操作。 3、检查显微镜的各个部件是否完整和正常。 4、向内转动粗调节器，使载物台略为上升，再转动转换器，让转换器边缘的缺刻与固 定卡相扣合，以使低倍镜的光轴对准镜筒中心和通光孔。 5、打开光圈，上升集光器。 ⑵对光：从目镜观察，同时两手转动反光镜，使镜面正对光源，直到镜内出现均匀且亮 度适中的圆形亮光，这个发亮的范围称为视野
(3)放置标本：左手取所观察的玻片标本，将有盖玻片的一面朝上，从显微镜左侧放到载 物台上；右手用弹簧卡卡住载玻片，然后转动推进器螺旋将所要观察的标本调至通光孔的中 央。 (④)调节焦距：调焦是初学者较难掌握的一步，必须反复练习，才能熟练掌握。为了能得 到清晰渐的物像，必须调节物镜与标本之间的距离，使它与物镜的工作距离相符合，这种操作 叫调焦。首先，眼晴从侧面注视低倍镜，双手内旋粗调节器，使载物台缓慢上升直到物镜的 工作距离为3mm。然后，一边从目镜观察，一边用手外旋粗调节器，使载物台缓慢下降或 物镜头上升，直到视野内出现清晰的物像为止。 (⑤)注意：这一操作过程有四种可能视野内不见物像： ①要观察的标本不在视野内，这需要调整玻片位置。 ②焦距没有调好，物镜头与玻片标本间的距离大于或小于低（高）倍镜的工作距离， 这需要重新调节焦距。 ③标本太小，需用推进器反复找或更换标本。 ④标本的颜色浅或透明，这应调节聚光镜或光圈，使视野变暗。 2、高倍镜的使用方法 在使用高倍镜之前，必须在低倍镜下找到清晰的物像，并把欲放大的部位移到视野的正 中央。然后从侧面注视，右手转动转换器，换上高倍镜，再用眼观察，此时大都能见到一个 不太清晰的物像。接着再用细调节器调节焦距，直至见到清晰的物像。注意，如果不出现物 像或物像模糊，可查看切片是否放反了或切片过厚以及物镜是否松动或被污染等情况后重新 操作。 3、油镜的使用方法 (在使用油镜时，必须先经低、高倍镜观察找到合适部位和清晰的物像，并将要进一步 放大仔细观察的部位移到视野中央。然后从侧面注视，转动转换器，使物镜头离开通光孔， 并在需要观察部位的盖片上加一滴香柏油，换上油镜头，使其浸在油滴中再用眼观察，同时 转动细调节器并开大光圈，直到出现清晰的物像。 ②)使用注意：在转动转换器时，一定要认清油镜以免污染其他镜头。另外油镜使用完毕 后，载物台下降，把油镜头转高光轴，用醮有二甲苯的擦镜纸将镜头上和带有盖片的切片上 的香柏油擦去。无盖片的切片，在其上滴一滴二甲苯后，用清水冲洗。 (三)使用显微镜应注意的事项 ()搬动显微镜时，应轻拿轻放且必须一手握镜臂，一手托镜座，紧贴胸前，以防目镜
⑶放置标本：左手取所观察的玻片标本，将有盖玻片的一面朝上，从显微镜左侧放到载 物台上；右手用弹簧卡卡住载玻片，然后转动推进器螺旋将所要观察的标本调至通光孔的中 央。 ⑷调节焦距：调焦是初学者较难掌握的一步，必须反复练习，才能熟练掌握。为了能得 到清晰的物像，必须调节物镜与标本之间的距离，使它与物镜的工作距离相符合，这种操作 叫调焦。首先，眼睛从侧面注视低倍镜，双手内旋粗调节器，使载物台缓慢上升直到物镜的 工作距离为 3mm。然后，一边从目镜观察，一边用手外旋粗调节器，使载物台缓慢下降或 物镜头上升，直到视野内出现清晰的物像为止。 ⑸注意：这一操作过程有四种可能视野内不见物像： ① 要观察的标本不在视野内，这需要调整玻片位置。 ② 焦距没有调好，物镜头与玻片标本间的距离大于或小于低（高）倍镜的工作距离， 这需要重新调节焦距。 ③ 标本太小，需用推进器反复找或更换标本。 ④ 标本的颜色浅或透明，这应调节聚光镜或光圈，使视野变暗。 2、高倍镜的使用方法 在使用高倍镜之前，必须在低倍镜下找到清晰的物像，并把欲放大的部位移到视野的正 中央。然后从侧面注视，右手转动转换器，换上高倍镜，再用眼观察，此时大都能见到一个 不太清晰的物像。接着再用细调节器调节焦距，直至见到清晰的物像。注意，如果不出现物 像或物像模糊，可查看切片是否放反了或切片过厚以及物镜是否松动或被污染等情况后重新 操作。 3、油镜的使用方法 ⑴在使用油镜时，必须先经低、高倍镜观察找到合适部位和清晰的物像，并将要进一步 放大仔细观察的部位移到视野中央。然后从侧面注视，转动转换器，使物镜头离开通光孔， 并在需要观察部位的盖片上加一滴香柏油，换上油镜头，使其浸在油滴中再用眼观察，同时 转动细调节器并开大光圈，直到出现清晰的物像。 ⑵使用注意：在转动转换器时，一定要认清油镜以免污染其他镜头。另外油镜使用完毕 后，载物台下降，把油镜头转离光轴，用醮有二甲苯的擦镜纸将镜头上和带有盖片的切片上 的香柏油擦去。无盖片的切片，在其上滴一滴二甲苯后，用清水冲洗。 （三）使用显微镜应注意的事项 ⑴搬动显微镜时，应轻拿轻放且必须一手握镜臂，一手托镜座，紧贴胸前，以防目镜