差分法测定谷氨酰胺的生物传感器研制 冯东黄加栋朱思荣刘仲汇冯德荣 (山东省科学院生物研究所济南250014,电话0531-2605395) 在分离纯化谷氨酸氧化酶过程中同时得到的谷氨酰胺水解酶。该酶与谷氨酸氧化酶的混合酶是制作谷氨酰胺酶膜 的好材料,制得的谷氨酰胺酶膜,可在具有差分分析功能的SBA-40C型生物传感分析仪上实现了谷氨酰胺的分析 该谷氨酸-谷氨酰胺双功能分析仪,有两个B0电极,一个电极装有复合酶膜,膜上固定着谷氨酰胺酶和谷氨酸 氧化酶,另一个电极上固定着谷氨酸氧化酶,两个酶膜反应最终产物H202由H202电极检测,经差分程序处理,测定 谷氨酰胺结果可自动把样品中本底谷氨酸值减去,从屏幕上直接显示测得谷氨酰胺含量及本底谷氨酸含量并自动打印 结果。此方法快速准确,有利于自动化分析,可广泛用于食品成分监测、质量检验及发酵在线控制及动物细胞培养。 测定原理: 谷氨酰胺酶 L-谷氨酰胺+H20 →L-谷氨酸+NH3(1) 谷氨酸氧化酶 L-谷氨酸+02+H20 →α-酮戊二酸+NH3+H202(2) 其中左电极为反应原理(2),右电极为反应原理()(2)。 2.谷氨酰胺测定系统的结构:谷氨酰胺测定系统由反应系统、两支过氧化氢电极和微机信号处理系统组成。结构 示意图如图1,左电极为谷氨酸酶电极,右电极为谷氨酰胺酶电极。 图1反应系统结构示意图 、有机玻璃块2、酶膜3、反应池4、进样针通道5、 反应池顶帽6、进样帽7、进样传感器8、电极9、电极 固定螺帽10、缓冲液排出管11、缓冲液进入管12、搅 拌子
差分法测定谷氨酰胺的生物传感器研制 冯东 黄加栋 朱思荣 刘仲汇 冯德荣 (山东省科学院生物研究所 济南 250014, 电话 0531-2605395) 在分离纯化谷氨酸氧化酶过程中同时得到的谷氨酰胺水解酶。该酶与谷氨酸氧化酶的混合酶是制作谷氨酰胺酶膜 的好材料，制得的谷氨酰胺酶膜，可在具有差分分析功能的 SBA-40C 型生物传感分析仪上实现了谷氨酰胺的分析。 该谷氨酸-谷氨酰胺双功能分析仪，有两个 H2O2 电极，一个电极装有复合酶膜，膜上固定着谷氨 酰胺酶和谷氨酸 氧化酶，另一个电极上固定着谷氨酸氧化酶，两个酶膜反应最终产物 H2O2 由 H2O2 电极检测，经差分程序处理，测定 谷氨酰胺结果可自动把样品中本底谷氨酸值减去，从屏幕上直接显示测得谷氨酰胺含量及本底谷氨酸含量并自动打印 结果。此方法快速准确，有利于自动化分析，可广泛用于食品成分监测、质量检验及发酵在线控制及动物细胞培养。 1. 测定原理： 谷氨酰胺酶 L-谷氨酰胺 + H2O ------→ L-谷氨酸 + NH3 (1) 谷氨酸氧化酶 L-谷氨酸 + O2 + H2O ------→ α-酮戊二酸 + NH3 + H2O2 (2) 其中左电极为反应原理(2)，右电极为反应原理(1) (2)。 2. 谷氨酰胺测定系统的结构：谷氨酰胺测定系统由反应系统、两支过氧化氢电极和微机信号处理系统组成。结构 示意图如图 1，左电极为谷氨酸酶电极，右电极为谷氨酰胺酶电极。 图 1 反应系统结构示意图 1、有机玻璃块 2、酶膜 3、反应池 4、进样针通道 5、 反应池顶帽 6、进样帽 7、进样传感器 8、电极 9、电极 固定螺帽 10、缓冲液排出管 11、缓冲液进入管 12、搅 拌子
3.测定方法 3.Ⅰ定标:开机后,用100mg/ 100ml谷氨酸标准液,进样量25ml,注入反应池后,20秒钟后显示打印数据,按 动″定标″钮定标100,对谷氨酸定标完成;按动"功能"?"3″?"100″?″输入″,再用10mM谷氨酰胺标准液进样量25m, 注入反应池后20秒显示打印结果,按动"1″键,则对谷氨酰胺定标完成。 3.2样品测定:定标后,注入25皿l待测样品于反应池中,20秒后显示打印结果,左屏幕显示谷氨酸含量 (ng/100m1),右屏幕显示谷氨酰胺含量(mM)。 4.仪器的稳定性和线性 对谷氨酸标准液(100mg/100ml)和谷氨酰胺标准液(10mM)连续测定20次,将数据进行统计处理,结果表明仪器测 定谷氨酰胺具有良好的稳定性(资料略)。 用不同浓度谷氨酰胺标准液来测定其线性,结果见表1。 表1、谷氨酰胺酶膜的线性试验 浓度(mM) 10 18 20 谷氨酰胺 响应值 2100127157 193212 表1结果表明,谷氨酰胺酶膜在8πM-20M浓度范围内,电极测定线性较好。该分析仪还设置有线性校正功能,可 以对电极进行线性校正 谷氨酰胺是动物细胞培养中很特殊的必需氨基酸,它既可作为细胞生长的主要能源,又可以作为氮源[1]。清华大 学化学工程系用我们硏制的谷氨酰胺分析仪,考察了储存和培养条件下谷氨酰胺的化学降解,及批次培养条件下谷氨 酰胺消耗与杂交瘤细胞生长之间的关系,得到了满意的数据和结果,该研究已形成文章发表[2] 参考文献 [1]许平,孙际宾等,谷氨酰胺的研究及开发进展,第二届全国发酵工程学术讨论会论文集,1998,235236. [2]辛艳,杨艳等,谷氨酰胺在杂交瘤细胞培养中的降解与代谢,生物工程学报,2001,17(4):478~480
3. 测定方法 3.1 定标：开机后，用 100mg/100ml 谷氨酸标准液，进样量 25ml，注入反应池后，20 秒钟后显示打印数据，按 动"定标"钮定标 100，对谷氨酸定标完成；按动"功能"?"3"?"100"?"输入"，再用 10mM 谷氨酰胺标准液进样量 25ml， 注入反应池后 20 秒显示打印结果，按动 "1"键，则对谷氨酰胺定标完成。 3.2 样品测定：定标后，注入 25ml 待测样品于反应池中，20 秒后显示打印结果，左屏幕显示谷氨酸含量 （mg/100ml ），右屏幕显示谷氨酰胺含量（mM）。 4. 仪器的稳定性和线性 对谷氨酸标准液（100mg/100ml ）和谷氨酰胺标准液（10mM）连续测定 20 次，将数据进行统计处理，结果表明仪器测 定谷氨酰胺具有良好的稳定性 (资料略) 。 用不同浓度谷氨酰胺标准液来测定其线性，结果见表 1。 表 1、 谷氨酰胺酶膜的线性试验 谷氨酰胺 浓度(mM ) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 响应值 5 26 49 72 100 127 157 169 193 212 表 1 结果表明，谷氨酰胺酶膜在 8mM-20mM 浓度范围内，电极测定线性较好。该分析仪还设置有线性校正功能，可 以对电极进行线性校正。 谷氨酰胺是动物细胞培养中很特殊的必需氨基酸，它既可作为细胞生长的主要能源，又可以作为氮源[1]。清华大 学化学工程系用我们研制的谷氨酰胺分析仪，考察了储存和培养条件下谷氨酰胺的化学降解，及批次培养条件下谷氨 酰胺消耗与杂交瘤细胞生长之间的关系，得到了满意的数据和结果，该研究已形成文章发表[2]。 参 考 文 献 [1]许平，孙际宾等，谷氨酰胺的研究及开发进展，第二届全国发酵工程学术讨论会论文集，1998，235~236. [2]辛艳，杨艳等, 谷氨酰胺在杂交瘤细胞培养中的降解与代谢，生物工程学报，2001，17（4）：478~480