SBA-70型血糖-乳酸自动分析仪研制 朱思荣周万里冯东毕春元冯德荣 (山东省科学院生物研究所山东省生物传感器重点实验室济南250014) 摘要:采用固定化酶传感器和流动注射研制了全自动血糖-乳酸分析仪。通 过转盘式样品盘和自动取样针实现了样品的自动采样,采用停流技术,增大酶传 感器的响应电流,提高测定精度。实验测试表明:仪器对标准样品的重复测定误 差小于2%,对不同浓度的样品有很好的线性响应,测定周期仅lmin左右。 关键词:生物传感器流动注射血糖乳酸自动分析仪 1.引言 生物传感器自上世纪60年代诞生以来,经过40多年的发展,技术已 日臻成熟,随着加工技术与计算机技术进展,仪器功能日益完善,操作越来越简 便。我们在80年代末生产了国内第一台商品化SBA-30型生物传感分析仪,用于 对运动员血乳酸的检测凹,至今已经多次更新换代,品种越来越多,应用范围越 来越广。基于当前的市场需求和国外同类仪器的研发状况,我们又成功地研 制了SBA-70型全自动血糖-乳酸分析仪,测试表明,仪器在1min内能自动完成 采样、分析、清洗全部操作,分析的重复性很好,误差小于2%,与其它方法对 比,相关性好,结果没有显著差异。 2.测定系统的工作原理 血糖-乳酸分析仪的传感器为酶电极,由基于生化反应的固定化酶膜和基于电化学 反应的过氧化氢电极复合而组成。本仪器的测定对象为葡萄糖和L-乳酸,固定化酶膜采 用美国 Sigma公司的葡萄糖氧化酶( Glucose oxidase)和L乳酸氧化酶(L- Lactate oxidase),经戊二醛固定化制成,测定过程中发生的酶促反应如下 葡萄糖+O2+O_葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸+H2O2 L-乳酸+O2+H2O L-乳酸氧化酶 丙酮酸+H2O 酶是一种特殊的具有催化活性的蛋白质,它的催化活性随保存时间的延长或测定样 品次数的增加会逐步降低,但酶经固定化处理后这一过程会显著变慢,固定化酶膜的保 存期达1年,使用寿命乳酸膜为15天以上,葡萄糖膜为30天以上。连续测定20个样 品只需20min左右,在这段时间内可以近似地把酶活性看作不变。 H2O2电极与固定化酶膜紧贴在一起,酶只在局部位置上起作用,在较短时间内,可 以认为缓冲液中测定样品和HO2的浓度不变,酶膜上底物浓度S是缓冲液中的底物向膜 内渗透和酶反应分解的综合结果,根据菲克扩散第一定律和酶反应米氏动力学公式,当
SBA-70 型血糖-乳酸自动分析仪研制 朱思荣 周万里 冯东 毕春元 冯德荣 （山东省科学院生物研究所 山东省生物传感器重点实验室 济南 250014） 摘要: 采用固定化酶传感器和流动注射研制了全自动血糖-乳酸分析仪。通 过转盘式样品盘和自动取样针实现了样品的自动采样，采用停流技术，增大酶传 感器的响应电流，提高测定精度。实验测试表明：仪器对标准样品的重复测定误 差小于 2%，对不同浓度的样品有很好的线性响应，测定周期仅 1min 左右。 关键词：生物传感器 流动注射 血糖 乳酸 自动分析仪 1. 引言 生物传感器自上世纪 60 年代诞生以来[1]，经过 40 多年的发展，技术已 日臻成熟，随着加工技术与计算机技术进展，仪器功能日益完善，操作越来越简 便。我们在 80 年代末生产了国内第一台商品化 SBA-30 型生物传感分析仪，用于 对运动员血乳酸的检测[2]，至今已经多次更新换代，品种越来越多，应用范围越 来越广[3~9]。基于当前的市场需求和国外同类仪器的研发状况，我们又成功地研 制了 SBA-70 型全自动血糖-乳酸分析仪，测试表明，仪器在 1min 内能自动完成 采样、分析、清洗全部操作，分析的重复性很好，误差小于 2%，与其它方法对 比，相关性好，结果没有显著差异。 2. 测定系统的工作原理 血糖-乳酸分析仪的传感器为酶电极，由基于生化反应的固定化酶膜和基于电化学 反应的过氧化氢电极复合而组成。本仪器的测定对象为葡萄糖和 L-乳酸，固定化酶膜采 用美国 Sigma 公司的葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase）和 L-乳酸氧化酶（L-Lactate oxidase），经戊二醛固定化制成[2]，测定过程中发生的酶促反应如下： 酶是一种特殊的具有催化活性的蛋白质，它的催化活性随保存时间的延长或测定样 品次数的增加会逐步降低，但酶经固定化处理后这一过程会显著变慢，固定化酶膜的保 存期达 1 年，使用寿命乳酸膜为 15 天以上，葡萄糖膜为 30 天以上。连续测定 20 个样 品只需 20min 左右，在这段时间内可以近似地把酶活性看作不变。 H2O2 电极与固定化酶膜紧贴在一起，酶只在局部位置上起作用，在较短时间内，可 以认为缓冲液中测定样品和 H2O2的浓度不变，酶膜上底物浓度 Sd是缓冲液中的底物向膜 内渗透和酶反应分解的综合结果，根据菲克扩散第一定律和酶反应米氏动力学公式，当
被测物的浓度很低时(S<K)时,有: Sa dt 其中D为底物通过支撑膜向酶膜层的扩散系数,S为缓冲液中的底物浓度,V为最 大反应速度,K。为米氏常数,因开始测定时,S=0计算后得到: S(1-e-t) Da B 另外,电极表面的HO浓度与酶生成HO的速度和HO2向缓冲溶液中的扩散速度有关 电极表面HO2浓度C与酶反应时间t的关系为: dc=- sa dt Dh Cdt 其中D为HO通过支撑膜向缓冲液的扩散系数,把(1)式代入(2)式得到电极表面HO2 浓度C随时间的变化关系为 ac Kmb Dd s(1-e-Bt)dt-DHCdt max 当HO2浓度的变化速率达到最大时,d2/dt2=0,从上式可得出这时HO2浓度变化速 率为 Da v DH K 实验表明,对同一酶膜,不同浓度的样品达到最大反应速度所需时间t是一致的,所以 e为一常数。在电极表面,HO2变化的最大速率与被测底物的浓度S成正比,通过测定 电极表面HO2变化的最大速率,并与标准底物作对比,即可计算出被测样品的浓度 3.测定系统的组成 酶反应自动流动注射系统由样品盘、自动取样针、恒温流动反应池、流动注射泵和 酶电极组成,其结构如图1所示
被测物的浓度很低时（S<<Km）时，有： 其中 Dd 为底物通过支撑膜向酶膜层的扩散系数，S 为缓冲液中的底物浓度，Vmax为最 大反应速度，Km 为米氏常数，因开始测定时，Sd = 0 计算后得到： 另外，电极表面的 H2O2浓度与酶生成 H2O2的速度和 H2O2向缓冲溶液中的扩散速度有关， 电极表面 H2O2浓度 C 与酶反应时间 t 的关系为： 其中 DH为 H2O2通过支撑膜向缓冲液的扩散系数，把（1）式代入（2）式得到电极表面 H2O2 浓度 C 随时间的变化关系为： 当 H2O2浓度的变化速率达到最大时，d2C/dt2 = 0，从上式可得出这时 H2O2浓度变化速 率为： 实验表明，对同一酶膜，不同浓度的样品达到最大反应速度所需时间 t 是一致的，所以 e -Bt为一常数。在电极表面，H2O2变化的最大速率与被测底物的浓度 S 成正比，通过测定 电极表面 H2O2变化的最大速率，并与标准底物作对比，即可计算出被测样品的浓度。 3. 测定系统的组成 酶反应自动流动注射系统由样品盘、自动取样针、恒温流动反应池、流动注射泵和 酶电极组成，其结构如图 1 所示
5 图1:自动流动注射系统示意图 1自动送样试管盘2.緩冲液入口3液流切换阀4.自动取样针5硅橡胶连接管 6流动注射管腔7.电极8流动反应池体9蠕动泵10废液出口 待测样品或标样用缓冲液定量稀释后放入自动取样试管盘,自动取样针固定在能上下移 动的机械轨道上,进样孔开在针的侧面,针尖部分是密封的。取样针下落时先吸入隔离 气泡,然后到达样品试管的底部,吸取待测样品或标样。吸样后,取样针上升再次吸取 隔离气泡,以分开吸取的样品。取样针上升到顶部位置时,从液流切换阀内吸取缓冲液, 驱动样品移动,进入反应池。取样和流动注射由蠕动泵控制,蠕动泵上安装定位传感 每次取样时蠕动泵位置相同,确保取样量一致。在反应池上并排放置二个酶电极,一次 进样可同时测定二个不同的组分。样品到达反应池后,采用停流技术,确保反应过程中 池内待测样品含量不变,使酶电极获得最大的响应信号 流动注射装置设计成合页状(申请专利号为:03139049.8),如图2 所示。放置酶膜的有机玻璃流动反应池与铝合金支撑体系的底部,通过固定销组 合在一起,能够方便地开合。固定化酶膜放在酶膜圈槽内,合上反应池后与过氧 化氢电极紧密接触。铝合金支撑体上装有恒温加热控制器,使系统温度恒定在 30℃左右,过氧化氢电极体大部分埋入恒温支撑体内,固定化酶传感器与过氧化 氢电极紧密贴在一起,使酶反应在恒温的环境下进行
待测样品或标样用缓冲液定量稀释后放入自动取样试管盘，自动取样针固定在能上下移 动的机械轨道上，进样孔开在针的侧面，针尖部分是密封的。取样针下落时先吸入隔离 气泡，然后到达样品试管的底部，吸取待测样品或标样。吸样后，取样针上升再次吸取 隔离气泡，以分开吸取的样品。取样针上升到顶部位置时，从液流切换阀内吸取缓冲液， 驱动样品移动，进入反应池。取样和流动注射由蠕动泵控制，蠕动泵上安装定位传感器， 每次取样时蠕动泵位置相同，确保取样量一致。在反应池上并排放置二个酶电极，一次 进样可同时测定二个不同的组分。样品到达反应池后，采用停流技术，确保反应过程中 池内待测样品含量不变，使酶电极获得最大的响应信号。 流动注射装置设计成合页状（申请专利号为：03139049.8），如图 2 所示。放置酶膜的有机玻璃流动反应池与铝合金支撑体系的底部，通过固定销组 合在一起，能够方便地开合。固定化酶膜放在酶膜圈槽内，合上反应池后与过氧 化氢电极紧密接触。铝合金支撑体上装有恒温加热控制器，使系统温度恒定在 30℃左右，过氧化氢电极体大部分埋入恒温支撑体内，固定化酶传感器与过氧化 氢电极紧密贴在一起，使酶反应在恒温的环境下进行
12 图2:双电极流动注射装置 1、过氧化氢电极2、流动反应池3、铝合金恒温支撑体系4、传感器膜圈槽 5、不锈钢流动池锁定装置、脱扣按钮 6、进液不锈钢管 7、出液不锈钢管 8、微动状态开关杠杆9、流动池锁定弹簧10、流动池固定销11、锁定装置固定销 12、流动池进液接口13、流动池出夜接口14、流动反应池自动锁定结构 仪器的电路由信号放大、AD转换、数据处理、机械系统驱动与控制、打印驱动与控制 等部分组成。用3个单片机实现仪器的自动测定功能。系统的组成如图3所示
仪器的电路由信号放大、AD 转换、数据处理、机械系统驱动与控制、打印驱动与控制 等部分组成。用 3 个单片机实现仪器的自动测定功能。系统的组成如图 3 所示
打印头 键盘浓晶显示器 电极信号1 RS232 接口 前置+AD 打印与信号采 主控制 集AT89S52 P89C58 时钟与数据 储存DS1644 前置+A/D 机械位置 机械动作控 蠕动泵电机 传感器 制AT89S52 电极信号 取样针电机 仪器状态 流动池 电机驱动 传感器 恒温信号 控制 样品盘电机 图3.仪器电路控制系统框图 3个单片机通过并口方式通讯,实现指令的传送与数据的接收与发送。由主控单片机 P89C58实现中文菜单式人机对话界面,测定过程控制和测定数据的处理,并实现与PC 机的数据通讯。仪器的数据保存采用DS1644,它的内置锂电池能保存数据和运行时钟 10年以上。传感器信号的采样、仪器状态的检测和点阵式打印头打印控制共用AT89S52 单片机。机械系统的定位运行,包括进样针的运行、样品盘的转动及样品的自动判断 蠕动泵步进电机的驱动及位置判断等控制,也由独立的单片机完成。采用3个单片机系 统的设计,各单片机功能明确,简化了系统的程序设计
3 个单片机通过并口方式通讯，实现指令的传送与数据的接收与发送。由主控单片机 P89C58 实现中文菜单式人机对话界面，测定过程控制和测定数据的处理，并实现与 PC 机的数据通讯。仪器的数据保存采用 DS1644，它的内置锂电池能保存数据和运行时钟 10 年以上。传感器信号的采样、仪器状态的检测和点阵式打印头打印控制共用 AT89S52 单片机。机械系统的定位运行，包括进样针的运行、样品盘的转动及样品的自动判断， 蠕动泵步进电机的驱动及位置判断等控制，也由独立的单片机完成。采用 3 个单片机系 统的设计，各单片机功能明确，简化了系统的程序设计