第九章DNA的生曲合成 2.定点开始单向复制 质粒 colEl是个典型的例子,复制从一个起点开始,以同一方向生长出两 条链,形成一个复制叉( replication fork) 3.两点开始单向复制 腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的,形成两个复制叉,各以一个单 一方向复制出一条新链。 总之DNA复制的起点及方向不仅原核细胞与真核细胞不同,就是同属于 原核生物和真核生物的不同种属也有相当大的差异。 (三)DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 1.解链酶( helicase) DNA开始复制时首先在起始点处解开双链,反应是在一种解链酶 ( helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB 蛋白就有解链酶活性,与随从链的模板DNA结合,沿5→3方向移动;还有 种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合,沿3→5方向移动。解链酶的 作用就是打开DNA双链之间的氢键。 2.单链结合蛋白( single strand binding proteins,SsBP) 它与解开的单链DNA结合,使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切 酶对单链DNA的水解,保证了单链DNA做为模板时的伸展状态,SSBP可以 重复利用 3.引发体的形成 DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成,一旦前导链DNA的聚 合作用开始,随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行
第九章 DNA 的生物合成 ·6· 2. 定点开始单向复制 质粒 colE1 是个典型的例子，复制从一个起点开始，以同一方向生长出两 条链，形成一个复制叉(replication fork)。 3. 两点开始单向复制 腺病毒 DNA 的复制是从两个起点开始的，形成两个复制叉，各以一个单 一方向复制出一条新链。 总之 DNA 复制的起点及方向不仅原核细胞与真核细胞不同，就是同属于 原核生物和真核生物的不同种属也有相当大的差异。 （三）DNA 复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 1. 解链酶(helicase) DNA 开始复制时首先在起始点处解开双链，反应是在一种解链酶 (helicase)的催化下进行的。解链酶需要 ATP 分解供给能量。大肠杆菌中 DnaB 蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板 DNA 结合，沿 5'→3'方向移动；还有 一种叫做 Rep 蛋白和前导链的模板 DNA 结合，沿 3'→5'方向移动。解链酶的 作用就是打开 DNA 双链之间的氢键。 2. 单链结合蛋白(single strand binding proteins, SSBP) 它与解开的单链 DNA 结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切 酶对单链 DNA 的水解，保证了单链 DNA 做为模板时的伸展状态，SSBP 可以 重复利用。 3. 引发体的形成 DNA 复制起始的关健步骤是前导链 DNA 的合成，一旦前导链 DNA 的聚 合作用开始，随从链 DNA 的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行
第九章DNA的生曲合成 的,所以它的起始相对简单,而随从链的合成是不连续进行的,所以引发阶 段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由 DnaB. dnaC和单链结合蛋白组成 (1)引物酶( primase) 它是一种特殊的RNA聚合酶,可催化短片段RNA的合成。这种短RNA 片段一般十几个至数十个核苷酸不等,它们在DNA复制起始处做为引物。 RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸 二酯键的位置 2)引发体( primosome 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发体促进了引物酶的结 合,共同形成引发体。引发体主要在DNA随从链上开始,它连续地与引物酶 结合并解离,从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物,在引物RNA 的3-OH末端接下去合成DNA片段,这就是随从链不连续合成的开始 (3)DNA连接酶 催化双链DNA中一条链上缺口的共价连接,形成3,5一磷酸二酯键 缺口上的3ˆ-OH,5’-磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基,连 接酶不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量, 大肠杆菌NAD,真核细胞ATP。 (4)、DNA解螺旋酶 DNA双螺旋在复制和修复中都必须解链,以便提供单链DNA模板。催 化DNA双螺旋解链,都有依赖双链DNA的 ATPase活性。水解ATP提供 解链所需能量。 复叉 解使赛 引物体 SsB二··↓ 二RNA引物 DNASE 前导 RNA引物
第九章 DNA 的生物合成 ·7· 复制叉的 移动方向 解旋酶 DNA聚 合酶III 解链酶 RNA引物 引物体 DNA聚 合酶I SSB 3´ 3´ 5´ 前导链 随后链 5´ 3´ 5´ RNA引物 3´ 3´ 的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶 段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由 DnaB. DnaC 和单链结合蛋白组成。 (1)引物酶(primase) 它是一种特殊的 RNA 聚合酶，可催化短片段 RNA 的合成。这种短 RNA 片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在 DNA 复制起始处做为引物。 RNA 引物的 3'-OH 末端提供了由 DNA 聚合酶催化形成 DNA 分子第一个磷酸 二酯键的位置。 (2)引发体(primosome) 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发体促进了引物酶的结 合，共同形成引发体。引发体主要在 DNA 随从链上开始，它连续地与引物酶 结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成 RNA 引物，在引物 RNA 的 3'-OH 末端接下去合成 DNA 片段，这就是随从链不连续合成的开始。 (3)DNA 连接酶 催化双链 DNA 中一条链上缺口的共价连接，形成 3’,5’－磷酸二酯键。 缺口上的 3’-OH，5’-磷酰基必须相邻。如果缺少一个或几个核苷酸残基，连 接酶不能将缺口弥合。也不能将两条游离的单链连接起来。需要消耗能量， 大肠杆菌 NAD+，真核细胞 ATP。 (4) 、DNA 解螺旋酶 DNA 双螺旋在复制和修复中都必须解链，以便提供单链 DNA 模板。催 化 DNA 双螺旋解链，都有依赖双链 DNA 的 ATPase 活性。水解 ATP 提供 解链所需能量
第九章DNA的生曲合成 (5)、拓扑异构E 大肠杆菌(原核生物)DNA为双链环形,其三级结构为麻花状超螺旋形 式,连环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的DNA分子 可因连环数不同而形成一系列拓扑异构体 引起拓扑异构反应的E,亦称旋转酶。有两种类型: 拓扑异构酶Ⅰ,松解螺旋,能切开一条DNA链在复制叉前面的一段DNA 的一个磷酸二酯键,允许该DNA链绕着另一条完整的DNA链自由旋转,而 后由拓扑异构酶重新形成磷酸二酯键。(不需AP,可切无DNA双螺旋中的 条链)。 拓扑异构酶Ⅱ(旋转E)细菌环形DNA复制后,两个DNA分子是互锁 的。该酶结合到一双链DNA环上,造成一暂时性的双链断裂,另一DNA环 正好从这一断裂处穿过,然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。(引入负超 螺旋,需AP,消除复制叉前进时产生的扭曲张力。在无AP时,可松解负 超螺旋。可同时切断DNA双链。) 三、DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子 DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下,将游离的 四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dP简写为dNTP)聚合成DNA的过程。 这是一个非常复杂的酶促反应,需要许多种酶和蛋白质参与,现分别叙述它 们在DNA复制中作用。 (一)DNA的聚合反应和DNA聚合酶 1957年, Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶I(DNA polymerase I,简写 DNA pol I),后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚 合酶Ⅲ。( DNA polymeraseⅡ,Ⅲ,简写 DNA pol II, DNA pol)。实验证明大 肠杆菌中DNA复制的主要过程靠 DNA pol起作用,而 DNA pol I和 DNA pol 在DNA错配的校正和修复中起作用 这种酶的共同性质是 1)需要DNA模板,因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP 2)需要RNA或DNA做为引物( primer),即DNA聚合酶不能从头催化 DNA的起始: 3)催化dNTP加到引物的3-OH末端,因而DNA合成的方向是5→3 4)三种DNA聚合酶都属于多功能酶,它们在DNA复制和修复过程的不 同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA 聚合酶的基本特点,所以我们着重介绍 DNA pol I的作用并指出另外二种 DNA pol的特殊性 1.DNA聚合酶I(P414)
第九章 DNA 的生物合成 ·8· (5) 、拓扑异构 E 大肠杆菌（原核生物）DNA 为双链环形，其三级结构为麻花状超螺旋形 式，连环数是表示超螺旋的一个参数。大小和一级结构完全相同的 DNA 分子， 可因连环数不同而形成一系列拓扑异构体。 引起拓扑异构反应的 E，亦称旋转酶。有两种类型： 拓扑异构酶Ⅰ，松解螺旋，能切开一条 DNA 链在复制叉前面的一段 DNA 的一个磷酸二酯键，允许该 DNA 链绕着另一条完整的 DNA 链自由旋转，而 后由拓扑异构酶重新形成磷酸二酯键。（不需 ATP，可切无 DNA 双螺旋中的 一条链）。 拓扑异构酶Ⅱ（旋转 E）细菌环形 DNA 复制后，两个 DNA 分子是互锁 的。该酶结合到一双链 DNA 环上，造成一暂时性的双链断裂，另一 DNA 环 正好从这一断裂处穿过，然后拓扑异构酶重新封上这个链的断口。（引入负超 螺旋，需 ATP，消除复制叉前进时产生的扭曲张力。在无 ATP 时，可松解负 超螺旋。可同时切断 DNA 双链。） 三、DNA 复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子 DNA 的复制实际上就是以 DNA 为模板在 DNA 聚合酶作用下，将游离的 四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为 dNTP)聚合成 DNA 的过程。 这是一个非常复杂的酶促反应，需要许多种酶和蛋白质参与，现分别叙述它 们在 DNA 复制中作用。 （一）DNA 的聚合反应和 DNA 聚合酶 1957 年，Arthur kornberg 首次在大肠杆菌中发现 DNA 聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ,简写 DNA polⅠ)，后来又相继发现了 DNA 聚合酶Ⅱ和 DNA 聚 合酶Ⅲ。(DNA polymerase Ⅱ，Ⅲ，简写 DNA polⅡ,DNA polⅢ)。实验证明大 肠杆菌中 DNA 复制的主要过程靠 DNA polⅢ起作用，而 DNA polⅠ和 DNA pol Ⅱ在 DNA 错配的校正和修复中起作用。 这种酶的共同性质是： 1）需要 DNA 模板，因此这类酶又称为依赖 DNA 的 DNA 聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, DDDP)； 2）需要 RNA 或 DNA 做为引物(primer)，即 DNA 聚合酶不能从头催化 DNA 的起始； 3）催化 dNTP 加到引物的 3'-OH 末端，因而 DNA 合成的方向是 5'→3'； 4）三种 DNA 聚合酶都属于多功能酶，它们在 DNA 复制和修复过程的不 同阶段发挥作用。由于 DNA 聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他 DNA 聚合酶的基本特点，所以我们着重介绍 DNA polⅠ的作用并指出另外二种 DNA pol 的特殊性。 1. DNA 聚合酶Ⅰ（P414）
第九章DNA的生曲合成 DNA pol I是由一条多肽链组成,分子量为109KD。酶分子中含有一个 Zn2+,是聚合活性必须的 大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子,每个酶分子每分钟在37℃下能 催化667个核苷酸参入到DNA链中,用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个 片段,大片段分子量为76KD,通常称为 klenow片段,小片段为34KD。大小 片段具有不同的酶活性 1)DNA聚合酶的5→3聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性,按模板DNA上的核苷酸顺序,将互补 的dNTP逐个加到引物RNA3-OH末端,并促进3-OH与dNTP的5-PO4形 成磷酸二酯键,酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对 时才有催化作用,5→3聚合活性存在于 klenow片段上。 2)DNA聚合酶的3→5外切核酸酶活性 这种酶活性的主要功能是从3'→5方向识别并切除DNA生长链末端与模 板DNA不配对而游离的核苷酸,这种功能称为校对功能,这是保证其聚合作 用的正确性不可缺少的,因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的 3-5外切 图:DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点 (3)DNA聚合酶的5→3外切核酸酶活性: 这种酶活性是从DNA链的5端向3末端水解已配对的核苷酸,本质是切 断磷酸二酯键,每次能切除10个核苷酸。因此,这种酶活性在DNA损伤的 修复中可能起重要作用,对完成的DNA片段去除5端的RNA引物也是必须 的 DNA pol I的5→3聚合活性和5→3外切酶活性协同作用,可以使DNA 条链上的切口从5→3方向移动,这种反应叫做缺刻平移( nick translation) 利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(a-32 PdNTP)的标记制成探针 ( probe),进行核酸的分子杂交实验,是现代分子生物学的一项重要技术(见右 许多实验证实 DNA pol I并不是DNA复制过程中的主要酶,它的作用主 要与DNA损伤后的修复有关 2DNA聚合酶( DNA pol ll) 分子量为120KD,每个细胞约有100个酶分子,活性只有 DNA pol I I的
第九章 DNA 的生物合成 ·9· 3´ 3´ 5´ 5´ 错配碱基 3´- 5´核酸外切 酶水解位点 3´- 5´核酸外切 酶水解位点 DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为 109KD。酶分子中含有一个 Zn2+，是聚合活性必须的。 大肠杆菌每个细胞中约有 400 个酶分子，每个酶分子每分钟在 37℃下能 催化 667 个核苷酸参入到 DNA 链中，用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水解成两个 片段，大片段分子量为 76KD，通常称为 klenow 片段，小片段为 34KD。大小 片段具有不同的酶活性。 1）DNA 聚合酶的 5'→3'聚合活性 这是 DNA 聚合酶最主要的活性，按模板 DNA 上的核苷酸顺序，将互补 的 dNTP 逐个加到引物 RNA 3'-OH 末端，并促进 3'-OH 与 dNTP 的 5'-PO4 形 成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的 dNTP 必须与模板 DNA 碱基配对 时才有催化作用，5'→3'聚合活性存在于 klenow 片段上。 2）DNA 聚合酶的 3'→5'外切核酸酶活性 这种酶活性的主要功能是从 3'→5'方向识别并切除 DNA 生长链末端与模 板 DNA 不配对而游离的核苷酸，这种功能称为校对功能，这是保证其聚合作 用的正确性不可缺少的，因此对于 DNA 复制中极高的保真性是至关重要的。 图：DNA 聚合酶的 3´- 5´外切酶水解位点 (3)DNA 聚合酶的 5'→3'外切核酸酶活性： 这种酶活性是从 DNA 链的 5'端向 3'末端水解已配对的核苷酸，本质是切 断磷酸二酯键，每次能切除 10 个核苷酸。因此，这种酶活性在 DNA 损伤的 修复中可能起重要作用，对完成的 DNA 片段去除 5'端的 RNA 引物也是必须 的。 DNA polⅠ的 5'→3'聚合活性和 5'→3'外切酶活性协同作用，可以使 DNA 一条链上的切口从 5'→3'方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)， 利用此反应可在体外对 DNA 片段进行放射性磷(α- 32PdNTP)的标记制成探针 (probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术（见右 图）。 许多实验证实 DNA polⅠ并不是 DNA 复制过程中的主要酶，它的作用主 要与 DNA 损伤后的修复有关。 2. DNA 聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ) 分子量为 120KD，每个细胞约有 100 个酶分子，活性只有 DNA polⅠ的