《园艺植物生物技术》 综合性实验指导书 刘成明编 华南农业大学 园艺学院果树学系 二OO三年十二月
《园艺植物生物技术》 综合性实验指导书 刘成明 编 华南农业大学 园艺学院果树学系 二○○三年十二月
《园艺植物生物技术》 综合性实验指导书 实验名称：名优高档花卉的离体培养快速繁殖及其过渡移栽 隶属课程：园艺植物生物技术 课程类别：必修课 预计学时：20学时 指导教师：刘成明教授 授课对象：园艺2001级
2 《园艺植物生物技术》 综合性实验指导书 实验名称: 名优高档花卉的离体培养快速繁殖及其过渡移栽 隶属课程: 园艺植物生物技术 课程类别: 必修课 预计学时: 20 学时 指导教师: 刘成明教授 授课对象: 园艺 2001 级
一、前言 离体快繁是植物生物技术中最具应用价值的生物技术。本实验要求学生以 高档花卉如大花惠兰、蝴蝶兰、素心兰或金钱树为材料，以其低代培养材料、 叶片、花器官、营养芽或根尖为外植体，通过器官、原球茎或胚状体发生，实 现完整植株的离体再生。 本实验中，特别要求学生深刻理解“以芽繁芽”这一最重要的快繁体系并 熟练掌握相关操作技术。在经过一定时期的继代增殖，获得较多数量的增殖芽 苗后，还要进行炼苗和过渡移栽，直至小苗出圃定植，整个过程约3一4个月。 二、实验目的 经过本实验的全过程后，学生对“植物细胞全能性”、“再生作用”、“分生与 分化”等重要的基本理论将有更深刻的认识，另一方面，学生对园艺植物的生 物特性也将有较全面的认识体会，例如自养型与异养型的转化、温度、湿度、 光照及培养基质等环境条件对组培苗的重要影响作用等。该实验将理论和实践 相结合，能有助于学生将不同场合下学习的知识进行融会贯通，提高他们的动 手能力和分析、解决问题的能力。 三、材料和方法 (一)实验材料 1、植物材料：名优高档花卉（如大花惠兰、蝴蝶兰、素心兰、金钱树）的 低代增殖材料、无菌苗、叶片、花器官、营养芽和根尖等。 2、培养基MS培养基、改良MS培养基的各种母液、各种生长调节物质、 椰乳等天然附加物。培养基的具体配方先由学生查资料自行设计，然后由 指导教师审查定夺。 3、实验用具：玻璃试管、培养容器、三角瓶、移液枪、高压消毒锅、超净 工作台、培养室 (二)实验方法
3 一、 前言 离体快繁是植物生物技术中最具应用价值的生物技术。本实验要求学生以 高档花卉如大花惠兰、蝴蝶兰、素心兰或金钱树为材料，以其低代培养材料、 叶片、花器官、营养芽或根尖为外植体，通过器官、原球茎或胚状体发生，实 现完整植株的离体再生。 本实验中，特别要求学生深刻理解“以芽繁芽”这一最重要的快繁体系并 熟练掌握相关操作技术。在经过一定时期的继代增殖，获得较多数量的增殖芽 苗后，还要进行炼苗和过渡移栽，直至小苗出圃定植，整个过程约 3－4 个月。 二、实验目的 经过本实验的全过程后，学生对“植物细胞全能性”、“再生作用”、“分生与 分化”等重要的基本理论将有更深刻的认识，另一方面，学生对园艺植物的生 物特性也将有较全面的认识体会，例如自养型与异养型的转化、温度、湿度、 光照及培养基质等环境条件对组培苗的重要影响作用等。该实验将理论和实践 相结合，能有助于学生将不同场合下学习的知识进行融会贯通，提高他们的动 手能力和分析、解决问题的能力。 三、材料和方法 （一）实验材料 1、 植物材料：名优高档花卉（如大花惠兰、蝴蝶兰、素心兰、金钱树）的 低代增殖材料、无菌苗、叶片、花器官、营养芽和根尖等。 2、 培养基 MS 培养基、改良 MS 培养基的各种母液、各种生长调节物质、 椰乳等天然附加物。培养基的具体配方先由学生查资料自行设计，然后由 指导教师审查定夺。 3、 实验用具：玻璃试管、培养容器、三角瓶、移液枪、高压消毒锅、超净 工作台、培养室 （二）实验方法
1、培养基制备 先将需要使用的母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿、量筒、烧杯、 移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。称量好所需的琼脂、蔗糖、蒸馏水， 配好所需用的生长调节物质，准备好分装容器。先在烧杯或锅内放一定量的蒸 馏水，加入琼脂和蔗糖并加热溶解，然后按母液顺序，根据不同母液的倍数吸 取规定的量。在加入母液或生长调节物质时，应事先检查这些母液是否已变色 或产生沉淀或结晶，已失效的就不要取用。加完所有的培养基组份（包括所需 的生长调节物质)后，继续加温并不断搅拌，待琼脂完全溶化后定容，调整pH 值为5.8-6.2，趁热分装后于高压灭菌锅内进行热压灭菌，灭菌结束后冷却备用。 2、外植体的消毒及初代培养 接种前l5min开机，使超净工作台自我洁净。操作者做好个人卫生、穿戴 好工作服及口罩后，在工作台上用70%酒精擦拭双手和台面，晾干双手，小心 点燃酒精灯，双手尽量不要离开无菌区。在灯焰上灼烧接种工具（镊子和手术 刀等)，冷却备用。 根据外植体的来源和种类，按照下表选择适合的表面消毒方法，对外植体 进行灭菌、清洗和切取，将切割好的材料接种于新鲜培养基上，放置于培养室 或光照培养箱内进行培养。 常用消毒剂的使用方法和效果 消毒剂 使用浓度/% 消毒时间7 min 灭菌效果清除难易 次氯酸钠 20 5-30 很好 易 次氯酸钙 9.010.0 5-30 很好 易 漂白粉 饱和溶液 5~30 很好 易 升汞(HgC2) 0110 2~10 最好 很雅 酒精 70-75 0.2-2 好 易 过氧化氢 10.0-12.0 515 极易 溴水 1.0-2.0 2~10 很好 易 硝酸银 1.0 5-30 好 较难 抗生素 0.0004-0.005 30-60 较好 中
4 1、培养基制备 先将需要使用的母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿、量筒、烧杯、 移液管、玻璃棒、漏斗等放在指定的位置。称量好所需的琼脂、蔗糖、蒸馏水， 配好所需用的生长调节物质，准备好分装容器。先在烧杯或锅内放一定量的蒸 馏水，加入琼脂和蔗糖并加热溶解，然后按母液顺序，根据不同母液的倍数吸 取规定的量。在加入母液或生长调节物质时，应事先检查这些母液是否已变色 或产生沉淀或结晶，已失效的就不要取用。加完所有的培养基组份（包括所需 的生长调节物质）后，继续加温并不断搅拌，待琼脂完全溶化后定容，调整 pH 值为 5.8-6.2，趁热分装后于高压灭菌锅内进行热压灭菌，灭菌结束后冷却备用。 2、外植体的消毒及初代培养 接种前 15min 开机，使超净工作台自我洁净。操作者做好个人卫生、穿戴 好工作服及口罩后，在工作台上用 70％酒精擦拭双手和台面，晾干双手，小心 点燃酒精灯，双手尽量不要离开无菌区。在灯焰上灼烧接种工具（镊子和手术 刀等），冷却备用。 根据外植体的来源和种类，按照下表选择适合的表面消毒方法，对外植体 进行灭菌、清洗和切取，将切割好的材料接种于新鲜培养基上，放置于培养室 或光照培养箱内进行培养。 常用消毒剂的使用方法和效果 消毒剂 使用浓度/％ 消毒时间／ min 灭菌效果 清除难易 次氯酸钠 2.0 5～30 很好 易 次氯酸钙 9.0～10.0 5～30 很好 易 漂白粉 饱和溶液 5～30 很好 易 升汞（HgCl2） 0.1～1.0 2～10 最好 很难 酒精 70～75 0.2～2 好 易 过氧化氢 10.0～12.0 5～15 好 极易 溴水 1.0～2.0 2～10 很好 易 硝酸银 1.0 5～30 好 较难 抗生素 0.0004～0.005 30～60 较好 中
3、继代培养（增殖培养） 待培养材料生长一段时间后，需要进行继代培养，以实现芽苗或原球茎数 量上的增殖。具体方法是：在超净工作台上做好接种准备后（同初代培养），取 一瓶培养材料，于灯焰上烧瓶口，使灰尘固定于瓶壁并杀死附着的微生物。在 灯焰的侧上方小心打开瓶盖，将瓶盖倒扣于台面上。用镊子取出材料，在无菌 纸或无菌器皿中进行切割。以同样的方法打开新鲜培养基的瓶盖，将切割好的 材料接种于培养基，小心盖回瓶盖，用力拧紧。接种完一批切割的材料后，清 理台面并用酒精擦拭。灼烧工具，准备做下一瓶材料。为避免微生物掉落于培 养瓶内，操作时应将瓶拿成斜角，并禁止大声讲话。接种好的材料放置于培养 室或光照培养箱内进行培养。 4、生根培养 按照无菌操作规程，挑选生长较好的增殖材料，分割粗壮的芽苗或原球茎 接种于生根培养基上，放置于培养室或光照培养箱内进行培养，并提高光照强 度以增强生根苗的自养能力，待小苗长至一定大小后进行过渡移栽。 5、炼苗及移栽 打开瓶盖于自然条件下炼苗23天，取出小苗，洗去附着的培养基，测定小 苗的株高、叶片数、根数、根长度等性状后，移栽于人工基质中（由泥炭、珍 珠岩、蛭石、水苔、河沙等混配而成)，进行遮荫、保湿等处理（一般在温室大 棚内进行过渡移栽)，直至植株成活并生长成健壮的出圃苗。 四、作业要求 每人写一份详细的实验报告，用A4纸（页边距：上、下、左、右个2.5Cm) 打印一份、并提供电子文挡一份（发e-mail或提供软盘)给教师，作为评定成 绩的主要依据。实验报告的主要内容包括：“实验名称”、“姓名”、“学院年级班 别”、“前言”、“实验目的”、“材料和方法”、“结果与分析（包括培养基制备
5 3、继代培养（增殖培养） 待培养材料生长一段时间后，需要进行继代培养，以实现芽苗或原球茎数 量上的增殖。具体方法是：在超净工作台上做好接种准备后（同初代培养），取 一瓶培养材料，于灯焰上烧瓶口，使灰尘固定于瓶壁并杀死附着的微生物。在 灯焰的侧上方小心打开瓶盖，将瓶盖倒扣于台面上。用镊子取出材料，在无菌 纸或无菌器皿中进行切割。以同样的方法打开新鲜培养基的瓶盖，将切割好的 材料接种于培养基，小心盖回瓶盖，用力拧紧。接种完一批切割的材料后，清 理台面并用酒精擦拭。灼烧工具，准备做下一瓶材料。为避免微生物掉落于培 养瓶内，操作时应将瓶拿成斜角，并禁止大声讲话。接种好的材料放置于培养 室或光照培养箱内进行培养。 4、生根培养 按照无菌操作规程，挑选生长较好的增殖材料，分割粗壮的芽苗或原球茎 接种于生根培养基上，放置于培养室或光照培养箱内进行培养，并提高光照强 度以增强生根苗的自养能力，待小苗长至一定大小后进行过渡移栽。 5、炼苗及移栽 打开瓶盖于自然条件下炼苗 2-3 天，取出小苗，洗去附着的培养基，测定小 苗的株高、叶片数、根数、根长度等性状后，移栽于人工基质中（由泥炭、珍 珠岩、蛭石、水苔、河沙等混配而成），进行遮荫、保湿等处理（一般在温室大 棚内进行过渡移栽），直至植株成活并生长成健壮的出圃苗。 四、作业要求 每人写一份详细的实验报告，用 A4 纸（页边距：上、下、左、右个 2.5cm） 打印一份、并提供电子文挡一份（发 e-mail 或提供软盘）给教师，作为评定成 绩的主要依据。实验报告的主要内容包括：“实验名称”、“姓名”、“学院年级班 别”、“前言”、“实验目的”、“材料和方法”、“结果与分析（包括培养基制备