《园艺植物育种学》 设计性实验指导书 胡桂兵刘成明编 华南农业大学 园艺学院果树学系 2003年10月
《园艺植物育种学》 设计性实验指导书 胡桂兵 刘成明编 华南农业大学 园艺学院果树学系 2003 年 10 月
《园艺植物育种学》 设计性实验指导 实验名称：园艺植物基因组DNA的提取及RAPD分析 隶属课程：《园艺植物育种学》 课程类别：必修课 预计学时：6学时 指导教师：胡桂兵副教授、刘成明教授、胡志群实验师 授课对象：园艺专业本科生 1
1 《园艺植物育种学》 设计性实验指导 实验名称：园艺植物基因组 DNA 的提取及 RAPD 分析 隶属课程：《园艺植物育种学》 课程类别：必修课 预计学时：6 学时 指导教师：胡桂兵副教授、刘成明教授、胡志群实验师 授课对象：园艺专业本科生
实验一园艺植物基因组DNA的提取及浓度测定 1目的 掌握用改良SDS法提取园艺植物总DNA的原理和方法，并分别用核 酸蛋白测定仪和凝胶电泳法检测出所提DNA的质量。 2原理 2.1DM提取：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基疏酸 钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)这个离子型表面活性剂，溶解细胞 膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核 中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物）：再加入苯酚和氯仿等表面活性剂， 使蛋白变性：经离心除去果树的组织和变性蛋白：上清液中加入无水乙醇 使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得园艺植物总DNA溶液。 2.2分光光度（紫外吸收）法检测DNA质量：DNA的吸收峰在260nm, 对于双链DNA,OD26o=1.0时溶液浓度为50μgml,这样通过用紫外分光 光度计测定所提DNA溶液在26Onm的吸光值，可以计算出所提DNA的浓 度，计算公式为：DNA样品浓度（μg/μI)=OD26o×N(样品稀释倍数） ×50/1000。而蛋白质的吸收峰在280nm,核苷酸等小分子量物质的吸收峰 在230m,这样通过测定OD280和OD230的吸光值，计算出OD26o/OD20及 OD260/OD20的比值后，可以判断所提DNA的纯度：纯的DNA溶液其OD260 OD280及应为1.8，OD260/OD230应大于2.0。OD26/OD280大于1.9时，表明 有RNA污染；小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD230小于2.0时
2 实验一 园艺植物基因组 DNA 的提取及浓度测定 1 目的 掌握用改良 SDS 法提取园艺植物总 DNA 的原理和方法，并分别用核 酸蛋白测定仪和凝胶电泳法检测出所提 DNA 的质量。 2 原理 2.1 DNA 提取：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基硫酸 钠（sodium dodecyl sulfate，简称 SDS）这个离子型表面活性剂，溶解细胞 膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核 中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物）；再加入苯酚和氯仿等表面活性剂， 使蛋白变性；经离心除去果树的组织和变性蛋白；上清液中加入无水乙醇 使 DNA 沉淀；沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中，即得园艺植物总 DNA 溶液。 2.2 分光光度（紫外吸收）法检测 DNA 质量：DNA 的吸收峰在 260nm， 对于双链 DNA，OD260=1.0 时溶液浓度为 50μg/ml，这样通过用紫外分光 光度计测定所提 DNA 溶液在 260nm 的吸光值，可以计算出所提 DNA 的浓 度，计算公式为：DNA 样品浓度（μg/μl）= OD260×N（样品稀释倍数） ×50/1000。而蛋白质的吸收峰在 280nm，核苷酸等小分子量物质的吸收峰 在 230nm，这样通过测定 OD280和 OD230的吸光值，计算出 OD260/ OD280及 OD260/ OD230的比值后，可以判断所提DNA的纯度：纯的DNA 溶液其OD260/ OD280及应为 1.8，OD260/ OD230应大于 2.0。OD260/ OD280大于 1.9 时，表明 有 RNA 污染；小于 1.6 时表明有蛋白质或酚污染。OD260/ OD230小于 2.0 时
表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 2.3琼脂糖凝胶电泳检测DNM质量：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子， 沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同DNA, 其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量 的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发 射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游 离状态EB发射的荧光强度大I0倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。 用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。 3实验材料 每个学生做1个老师已经准备的幼嫩、健康的园艺植物叶片。 4仪器设备 高速冷冻离心机(Ependorf Centrifuge5810R)、高速台式离心机 (Ependorf Centrifuge5415D)、入电泳装置（包括BIO-RAD Sub-Cell192电 泳槽和PAC300电泳仪)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、Biophotometer核酸 蛋白测定仪、MicroBio Mixer Genius、液氮罐、振荡器、电子天平、恒温水 浴锅、烘箱、微波炉等
3 表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子， 沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同 DNA， 其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量 的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发 射荧光。EB 可与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，其发射的荧光强度较游 离状态 EB 发射的荧光强度大 10 倍以上，且荧光强度与 DNA 含量成正比。 用肉眼观察，可检测到 5ng 以上的 DNA。 3 实验材料 每个学生做 1 个老师已经准备的幼嫩、健康的园艺植物叶片。 4 仪器设备 高速冷冻离心机（Ependorf Centrifuge 5810R）、高速台式离心机 （Ependorf Centrifuge 5415D）、电泳装置（包括 BIO-RAD Sub-Cell 192 电 泳槽和 PAC300 电泳仪）、凝胶成像系统（BIO-RAD）、Biophotometer 核酸 蛋白测定仪、MicroBio Mixer Genius、液氮罐、振荡器、电子天平、恒温水 浴锅、烘箱、微波炉等
5实验用具 50ml离心管(3只/个材料)、1.5ml离心管(3只/个材料)、研钵（每 人1套)、小剪刀、棉纱手套、不锈钢药匙、10ml移液管、50ml离心管架、 1.5ml离心管盒、吸耳球、1ml移液枪、1ml吸头、1ml吸头盒、100μ1移 液枪、200μ1吸头、200μ1吸头盒、10μ1移液枪、10μ1吸头、10μ1吸 头盒、冰盒、各种规格的试剂瓶若干个。 6试剂 液氮、改良SDS提取液【1.5%SDS(WV),100 mMTris-HCI(pH8.O), 20 nMEDTA(pH8.0),500 nMNaCl,3.0%PVP(WW),0.2%B-巯基乙醇 (VV)小、氯仿-异戊醇(24：1)无水乙醇、70%乙醇、TE、RNA酶(10mg/ml)、 琼脂糖、TAE、5 MNaCl、DNA分子量标记、EB溶液(O.5μgml) 7实验步骤 (1)、在电子天平上称取1.0克用小剪刀剪去主脉的幼嫩叶片，于液态N2 中研磨成粉末。 (2)、用不锈钢药匙把粉末立即转入50ml离心管中，加入15ml经65℃预 热的改良SDS提取液，于65℃水浴锅中裂解60min,其间轻摇数次。 (3)、加入l5ml氯仿-异戊醇，用MicroBio Mixer Genius或双手上下颠倒 震荡10min(第一次去蛋白)。 (4)、4000rpm,离心10min。 (5)、用1ml移液枪转上清液于新的50ml离心管中
4 5 实验用具 50ml 离心管（3 只/个材料）、1.5ml 离心管（3 只/个材料）、研钵（每 人 1 套）、小剪刀、棉纱手套、不锈钢药匙、10ml 移液管、50ml 离心管架、 1.5ml 离心管盒、吸耳球、1ml 移液枪、1ml 吸头、1ml 吸头盒、100μl 移 液枪、200μl 吸头、200μl 吸头盒、10μl 移液枪、10μl 吸头、10μl 吸 头盒、冰盒、各种规格的试剂瓶若干个。 6 试剂 液氮、改良 SDS 提取液【1.5%SDS(W/V)，100mMTris-HCl(pH8.0)， 20mMEDTA(pH8.0)，500mMNaCl，3.0%PVP(W/V)，0.2%β-巯基乙醇 (V/V)】、氯仿-异戊醇（24：1）、无水乙醇、70％乙醇、TE、RNA 酶（10mg/ml）、 琼脂糖、TAE、5M NaCl、DNA 分子量标记、EB 溶液（0.5μg/ml） 7 实验步骤 （1）、在电子天平上称取 1.0 克用小剪刀剪去主脉的幼嫩叶片，于液态 N2 中研磨成粉末。 （2）、用不锈钢药匙把粉末立即转入 50ml 离心管中，加入 15ml 经 65℃预 热的改良 SDS 提取液，于 65℃水浴锅中裂解 60min，其间轻摇数次。 （3）、加入 15ml 氯仿-异戊醇，用 MicroBio Mixer Genius 或双手上下颠倒 震荡 10min（第一次去蛋白）。 （4）、4000rpm，离心 10min。 （5）、用 1ml 移液枪转上清液于新的 50ml 离心管中