酶工程电子教案 第五章酶、细胞、原生质体固定化 ◆酶的一些不足之处 (1)酶的稳定性较差 (2)酶的一次性使用 (3)产物的分离纯化较困难 ◆改善方法之一就是固定化技术的应用: (1)固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化 酶既保持了酶的催化特性,又克服了游窝酶的不足之处,具有增加稳定性,可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著优点 (2)固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称为 固定化活细胞或固定化增值细胞。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。 (3)固定化原生质体技术,有利于胞内物质的分泌。 1.酶固症化 ◆采用各种方法,将酶与水不溶性的载体结合,制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定 在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。 固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体,它是固定化酶的一种形式。 11酶的固定化方法 固定化的方法:吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。 (1)吸附法: ◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上,而使酶固定化的方法称为物理吸附 法,简称吸附法
1 酶工程电子教案 第五章 酶、细胞、原生质体固定化 ◆酶的一些不足之处： （1）酶的稳定性较差 （2）酶的一次性使用 （3）产物的分离纯化较困难 ◆改善方法之一就是固定化技术的应用: (1)固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化 酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增加稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著优点。 (2)固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称为 固定化活细胞或固定化增值细胞。通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产。 (3) 固定化原生质体技术，有利于胞内物质的分泌。 1. 酶固定化 ◆采用各种方法，将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定 在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。 ◆固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。 1.1 酶的固定化方法 固定化的方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。 (1)吸附法： ◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附 法，简称吸附法
◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔珓璃、硅胶、 羟基磷灰石等。 ◆靠物理吸附作用,结合力较弱,酶与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用受到定的限 (2)包埋法 ◆将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法 ◆包埋法使用的多孔载体主要有∶琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、 光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等 ◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时,根据载体材料和方法的不同,可分为凝胶包埋法和 半透膜包埋法两大类 °凝胶包埋法∶凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝内部的微孔中,制成一定形状 的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状,也可按需要制成其他形状。 常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝 胶、光交联树脂等合成凝胶 ◇半透膜包埋法∵半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内,制成固定 化酶 常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。 (3)结合法 ◆选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 ◆根据酶与载体结合的化学键不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。 ◇窝子键结合法:通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。 离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素
2 ◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、 羟基磷灰石等。 ◆靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限 制。 (2)包埋法 ◆将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 ◆包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、 光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。 ◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和 半透膜包埋法两大类。 ◇凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状 的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要制成其他形状。 常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝 胶、光交联树脂等合成凝胶。 ◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定 化酶。 常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等。 (3)结合法 ◆选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。 ◆根据酶与载体结合的化学键不同，结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。 ◇离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。 离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有 DEAE-纤维素
TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 ◇共价键结合法:通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。 共价键结合法所采用的载体主要有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基 酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等 酶分子中可以形成共价键的基团主要有∶氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。 ◇要使载体与酶形成共价键,必须首先使载体活化,即借助于某种方法,在载体上引进 活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应,形成共价键。 ◇使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。 (4)交联法 ◆借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联 法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 ◆常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的 是戊二醛。 (5)热处理法 ◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定在菌体内,而制备得到固定化菌体 ◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化,在加热处理时,要严格控制好加热温 度和时间,以免引起酶的变性失活 12固定化酶的特性 (1)稳定性固定化酶的稳定性一般比游窝酶的稳定性好 (2)最适温度:固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多,活化能也变化不大。 (3)最适pH值:酶经过固定化后,其作用的最适pH值往往会发生一些变化 ◆影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个,一个是载体的带电性质,另一个是酶催
3 TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 ◇共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。 共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基 酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。 ◇要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进 一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。 ◇使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。 (4)交联法 ◆借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联 法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 ◆常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的 是戊二醛。 (5)热处理法 ◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。 ◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温 度和时间，以免引起酶的变性失活。 1.2 固定化酶的特性 (1)稳定性:固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 (2)最适温度: 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。 (3)最适 pH 值: 酶经过固定化后，其作用的最适 pH 值往往会发生一些变化。 ◆影响固定化酶最适 pH 值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催
化反应产物的性质 (4)底物特异性:固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同其变化与底物分子量的 大小有一定关系。对于那些作用于低分子底物的酶固定化前后的底物特异性没有明显变化。 ◆固定化酶底物特异性的改变,是由于载体的空间位阻作用引起的 13固定化酶的应用 固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有如下显著的优点 (1)酶的稳定性增加,减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响, 可以较长期地保持较高的酶活力 (2)固定化酶可反复使用或连续使用较长时间,提高酶的利用价值,降低生产成本。 (3)固定化酶易于和反应产物分开,有利于产物的分离纯化,从而提高产品质量 固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领 域 2细胞固定化 ◆通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合,制备固定化细胞的过程称为细胞固定 化。(固定化活细胞或固定化增殖细胞) ◆微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞 21细胞固定化的方法 ◆主要可分为吸附法和包埋法两大类方法。 (1)吸附法 ◆利用各种固体吸附剂,将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 ◆用于细胞固定化的吸附剂主要有:硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝 网、微载体和中空纤维等
4 化反应产物的性质。 (4)底物特异性: 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的 大小有一定关系。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。 ◆固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。 1.3 固定化酶的应用 固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有如下显著的优点： （1）酶的稳定性增加，减少温度、pH 值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响， 可以较长期地保持较高的酶活力。 （2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间，提高酶的利用价值，降低生产成本。 （3）固定化酶易于和反应产物分开，有利于产物的分离纯化，从而提高产品质量。 固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领 域。 2.细胞固定化 ◆通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程称为细胞固定 化。(固定化活细胞或固定化增殖细胞) ◆微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。 2.1 细胞固定化的方法 ◆主要可分为吸附法和包埋法两大类方法。 (1)吸附法 ◆利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法。 ◆用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝 网、微载体和中空纤维等
(2)包埋法 ◆将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法 ◆包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法 ◇以各种多孔凝胶为载体,将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶 包埋法。 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法,适用于各种微生物、动物和植物 细胞的固定化。 凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海灜酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺 凝胶和光交联树脂等。 2.2微生物细胞固定化 2.21固定化微生物细胞的特点 ①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态,稳定性好。 ②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系,可以按照 原来的代谢途径迸行新陈代谢,并进行有效的代谢调节控制。 ③发酵稳定性好,可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。 ④固定化微生物细胞密度提高,可以提高产率。 ⑤提高工程菌的质粒稳定性 22.2固定化微生物细胞的应用 ◆主要用在两个方面 °是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物。 二是利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极。 (1)利用固定化微生物生产各种产物
5 (2) 包埋法 ◆将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。 ◆包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。 ◇以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶 包埋法。 ○凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物 细胞的固定化。 ○凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺 凝胶和光交联树脂等。 2.2 微生物细胞固定化 2.2.1 固定化微生物细胞的特点： ①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。 ②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系，可以按照 原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。 ③发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。 ④固定化微生物细胞密度提高，可以提高产率。 ⑤提高工程菌的质粒稳定性， 2.2.2 固定化微生物细胞的应用 ◆主要用在两个方面： ◇是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物。 ◇二是利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极。 (1)利用固定化微生物生产各种产物