EcoRI BamHI Pstl 外源DNA Tet抗性 (ampr) (tetr) 大肠杆菌pBR322质粒 转化大肠杆菌 复制原点 透择转化 所有菌落都 培养基中 带有质粒DNA 图5-3重组DNA操作过程需 菌落转移进行筛选 示意图。 养基中含有培养基中含有柳:c:PGE
图5-3 重组DNA操作过程 示意图
表52重组DA实验中常见的主要工具酶 酶 类 功 能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接 成一个DNA分子 DA聚合酶I(大肠杆「按5到3方向加入新的核苷酸,补平D双 菌) 链中的缺口 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列,根据碱基互补 原则合成DNA链 多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端 (进行末端标记实验或用来进行DNA的连接 末端转移酶 在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶II 从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸 λ噬菌体DNA外切酶 从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团NPE&PGE
表5-2 重组DNA实验中常见的主要工具酶 酶 类 功 能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接 成一个DNA分子 DNA聚合酶 I（大肠杆 菌） 按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双 链中的缺口 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补 原则合成DNA链 多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端 （进行末端标记实验或用来进行DNA的连接 末端转移酶 在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶III 从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸 λ噬菌体DNA外切酶 从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团
5.2DNA操作技术 5.2.1核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖( agarose)和聚丙烯酰胺 ( polyacrylamide)凝胶被引入核酸研究 以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳 技术,已经发展成为一种分析鉴定重组 DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要 实验手段。 nlpe& Pge
5. 2 DNA操作技术 5. 2. 1核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺 （polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究 以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳 技术，已经发展成为一种分析鉴定重组 DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要 实验手段
基本原理 一种分子被放置到电场中,它就 会以一定的速度移向适当的电极。我 们把这种电泳分子在电场作用下的迁 移速度,叫做电泳的迁移率,它与 电场强度和电泳分子本身所携 带的净电荷数成正比,与片段 大小成反比。 nlpe& Pge
基本原理 一种分子被放置到电场中，它就 会以一定的速度移向适当的电极。我 们把这种电泳分子在电场作用下的迁 移速度，叫做电泳的迁移率，它与 电场强度和电泳分子本身所携 带的净电荷数成正比，与片段 大小成反比
生理条件下,核酸分子中的磷酸 基团呈离子化状态,所以,DNA和 RNA又被称为多聚阴离子 ( polyanions),在电场中向正电极 的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重 复性质,相同数量的双链DNA几乎 具有等量的净电荷,因此它们能以 同样的速度向正电极方向迁移。 nlpe& Pge
生理条件下，核酸分子中的磷酸 基团呈离子化状态，所以，DNA 和 RNA 又被称为多聚阴离子 （polyanions），在电场中向正电极 的方向迁移。 由于糖 -磷酸骨架在结构上的重 复性质，相同数量的双链DNA几乎 具有等量的净电荷，因此它们能以 同样的速度向正电极方向迁移