重组DNA导入大肠杆菌的方法 细菌感受态细胞的制备过程 培养大肠 ODm至0.3 On ice 5-10 4℃离心收集 杆菌 0.4 mn On ice30用冰冷的 4℃离心收用冰冷的 mn 60 mMCac2重悬 集菌 60 mMCacl2重悬 4℃离心收集用冰冷的 分装、 60 mMCac2重悬 70℃冻存
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 细菌感受态细胞的制备过程 培养大肠 杆菌 OD600至0.3- 0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集 菌 用冰冷的 60mMCaCl2重悬 4℃离心收 集菌 4℃离心收集 菌 分装、 -70 ℃冻存 用冰冷的 60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的 60mMCaCl2重悬
重组DNA导入大肠杆菌的方法 重组体导入受体细胞 简单,但转化效率不高(106-103/gDNA) 10ng载体DNA 吸附DNA 摄入DNA On ice混合,静 置30分钟 →|42C15分钟 100μL感受态菌 热休克法 10-100u转化液涂含抗 加入1mLLB培 菌素的平板 37℃摇1小时 养基
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 重组体导入受体细胞 10ng载体DNA 100L感受态菌 On ice混合，静 置30分钟 37℃摇1小时 10-100L转化液涂含抗 菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA 加入1mL LB培 养基 42ºC 1.5分钟 热休克法 简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）
重组DNA导入大肠杆菌的方法 平板培养基培养细菌 10-100μL转化漩 z Suspension of 涂于合抗菌素的平板 Suspension spread on bacterial cells petri plate with agar gel Incubate from 1 to 2 days 37℃过夜 Petri plat with agar gel Single cells Visible colonies (not visible to naked eye) (each a clone of the corresponding single cell)
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 平板培养基培养细菌 10-100L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜
重组DNA导入大肠杆菌的方法 2电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转 化仪的样品池中,两极施加高压电场。 在强大电场的作用下,细菌细胞壁和细胞膜 生缝隙,质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔,使各 种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞 转化效率高(高于10gDNA)
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转 化仪的样品池中，两极施加高压电场。 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产 生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各 种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞. 转化效率高（高于109 /gDNA）
COno w □:■ Thymocytes