兽医免疫学实验指导 补充材料 郭鑫 编写 中国农业大学动物医学院预防兽医学系 二00五年十一月
兽医免疫学实验指导 补充材料 郭鑫 编写 中国农业大学动物医学院预防兽医学系 二 00 五年十一月
实验须知 在免疫学实验中，可能接触病原微生物，要求工作谨慎、严防实验室感染、防止事故、 确保安全。 (一)防止病原徽生物的散布 1.实验室中应着工作服，如沾有可传染的材料，应脱下浸于消毒药水中（如5%石炭酸等） 过夜或高压消毒后再进行洗涤。 2。沾有微生物的器皿及废弃培养物，应置于指定地点，先消毒后再进行洗涤：检查用过的 动物尸体、脏器、血液等，应严加消毒、掩埋。 3。接种环、接种针用前后必须置火焰中烧灼过。 4.含有培养物的试管不可平放桌面，以防止其中液体流出。 5。实验室中禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔和标签等物，亦勿用手指或他物与面部接触 6。操作危险材料时勿谈话或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外。 7.实验室中若发生意外，如吸入细菌、划破皮肤、细茵或病料污染桌面或地面等时，应立 即处理，必要时就医。为病原微生物所污染的地点，应敷以粘浓消毒药(%石炭酸等) 覆盖过夜。 8.菌种或毒种不得带出实验室。 9.工作完毕或应先用消毒药水、后用清水洗手。 (二)防火 一切易燃品应原离火源。不可将酒精灯倾斜向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。 (三)节约 1.使用药品试剂、染色剂、镜油、拭镜纸等应节约。 2。使用仪器等要小心，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外 3。吸管插入试管中时，要轻放到底才松手，以免戳破试管。 4.平皿一般应翻放，即皿底在上，皿盖在下，以免拿时皿底掉下摔破。 5.金属器皿用毕消毒后，应立即擦干，防止生锈 (四)标记
1 实验须知 在免疫学实验中，可能接触病原微生物，要求工作谨慎、严防实验室感染、防止事故、 确保安全。 （一）防止病原微生物的散布 1． 实验室中应着工作服，如沾有可传染的材料，应脱下浸于消毒药水中（如 5%石炭酸等） 过夜或高压消毒后再进行洗涤。 2． 沾有微生物的器皿及废弃培养物，应置于指定地点，先消毒后再进行洗涤；检查用过的 动物尸体、脏器、血液等，应严加消毒、掩埋。 3． 接种环、接种针用前后必须置火焰中烧灼过。 4． 含有培养物的试管不可平放桌面，以防止其中液体流出。 5． 实验室中禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔和标签等物，亦勿用手指或他物与面部接触。 6． 操作危险材料时勿谈话或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外。 7． 实验室中若发生意外，如吸入细菌、划破皮肤、细菌或病料污染桌面或地面等时，应立 即处理，必要时就医。为病原微生物所污染的地点，应敷以粘浓消毒药（5%石炭酸等） 覆盖过夜。 8． 菌种或毒种不得带出实验室。 9． 工作完毕或应先用消毒药水、后用清水洗手。 （二）防火 一切易燃品应原离火源。不可将酒精灯倾斜向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。 （三）节约 1．使用药品试剂、染色剂、镜油、拭镜纸等应节约。 2．使用仪器等要小心，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。 3．吸管插入试管中时，要轻放到底才松手，以免戳破试管。 4．平皿一般应翻放，即皿底在上，皿盖在下，以免拿时皿底掉下摔破。 5．金属器皿用毕消毒后，应立即擦干，防止生锈。 （四）标记
所用各种试剂、染料、培养物、动物等，均需标记明确。要经高压消毒或蒸气消毒的标 签，应用深色铅笔或记号笔书写，不可用毛笔或水笔书写，以免消毒后模糊不清 (五)记录 每项操作及结果观察都应有详细记录。 (六)安全 最后一人离开实验室前应对窗户、自来水开关、电源、煤气开关检查一遍，关好，锁门。 (七)清洁与秩序 每日开始工作前，地面酒水，清洁桌面。实验室中各物均有一定位置，工作完毕后放回 原处或指定地点，对实验室整理，清洁后离开
2 所用各种试剂、染料、培养物、动物等，均需标记明确。要经高压消毒或蒸气消毒的标 签，应用深色铅笔或记号笔书写，不可用毛笔或水笔书写，以免消毒后模糊不清。 （五）记录 每项操作及结果观察都应有详细记录。 （六）安全 最后一人离开实验室前应对窗户、自来水开关、电源、煤气开关检查一遍，关好，锁门。 （七）清洁与秩序 每日开始工作前，地面洒水，清洁桌面。实验室中各物均有一定位置，工作完毕后放回 原处或指定地点，对实验室整理，清洁后离开
实验一琼脂双向单扩散试验和琼脂 双向双扩散试验 [卖验目的] 1,掌握经典血清学反应中沉淀反应的原理和基本方法。 2.熟悉用琼脂双向单扩散方法进行抗原的半定量检测。 3.熟悉用琼脂双向双扩散方法进行抗原或抗体的定性检测及抗体效价的测定。 [实验原理] 1.琼脂双向单扩散琼脂是一种含有硫酸基的多糖聚合物，高温时可溶于水，冷却后 形成半固体凝胶状。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满液体，孔径的大小取决于琼脂浓度。在 1%的琼脂凝胶中，各种抗原或抗体分子可自由扩散。抗原、抗体分子在凝胶中相遇，在比 例适当处发生沉淀反应，在辐射型免疫扩散中，抗原、抗体相互结合，在最适比例处形成沉 淀环，当琼脂凝胶中的抗原或抗体浓度一定时，沉淀环的大小与扩散的抗体或抗原的浓度成 正比。浓度越大，形成的沉淀环也越大。该试验一般用于抗原或抗体的定量测定。 2。琼脂双向双扩散可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝胶中相向扩散，在两孔之间比 例最合适的位置出现抗原抗体反应沉淀带。用己知抗原或抗体可检测未知的抗体或抗原。该 方法已广泛用于临床诊断，抗体效价测定及抗原研究中。 [实验内容] 1.琼脂双向单扩散 (1)将1.2%琼脂用生理盐水溶化，并置于56℃水浴中保温。 (2)将抗血清在56℃水浴中预热。 (3)在100毫升琼脂中加入一定体积的抗血清（事先经预试验确定加入量），充分混匀。 (4)取3.5毫升血清琼脂浇于玻片上，冷却备用。 (5)打孔：用打孔器在每个琼脂板上等距离打4个孔，用酒精灯轻轻灼烧玻片另一面 进行封底。 (6)加样：取抗原做三个稀释度，每个稀释度加一个孔，最后一孔加未知浓度的抗原 待检样品。 (7)扩散：将玻片放于湿盒中，37℃扩散24小时，观察沉淀环
3 实验一 琼脂双向单扩散试验和琼脂 双向双扩散试验 [实验目的] 1．掌握经典血清学反应中沉淀反应的原理和基本方法。 2．熟悉用琼脂双向单扩散方法进行抗原的半定量检测。 3．熟悉用琼脂双向双扩散方法进行抗原或抗体的定性检测及抗体效价的测定。 [实验原理] 1．琼脂双向单扩散 琼脂是一种含有硫酸基的多糖聚合物，高温时可溶于水，冷却后 形成半固体凝胶状。琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满液体，孔径的大小取决于琼脂浓度。在 1％的琼脂凝胶中，各种抗原或抗体分子可自由扩散。抗原、抗体分子在凝胶中相遇，在比 例适当处发生沉淀反应，在辐射型免疫扩散中，抗原、抗体相互结合，在最适比例处形成沉 淀环，当琼脂凝胶中的抗原或抗体浓度一定时，沉淀环的大小与扩散的抗体或抗原的浓度成 正比。浓度越大，形成的沉淀环也越大。该试验一般用于抗原或抗体的定量测定。 2．琼脂双向双扩散 可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝胶中相向扩散，在两孔之间比 例最合适的位置出现抗原抗体反应沉淀带。用已知抗原或抗体可检测未知的抗体或抗原。该 方法已广泛用于临床诊断，抗体效价测定及抗原研究中。 [实验内容] 1．琼脂双向单扩散 （1）将 1.2％琼脂用生理盐水溶化，并置于 56ºC 水浴中保温。 （2）将抗血清在 56ºC 水浴中预热。 （3）在 100 毫升琼脂中加入一定体积的抗血清（事先经预试验确定加入量），充分混匀。 （4）取 3.5 毫升血清琼脂浇于玻片上，冷却备用。 （5）打孔：用打孔器在每个琼脂板上等距离打 4 个孔，用酒精灯轻轻灼烧玻片另一面 进行封底。 （6）加样：取抗原做三个稀释度，每个稀释度加一个孔，最后一孔加未知浓度的抗原 待检样品。 （7）扩散：将玻片放于湿盒中，37ºC 扩散 24 小时，观察沉淀环
(8)结果记录：用尺量取沉淀环半径（直径除2），计算各环面积。 (9)绘制曲线：以抗原浓度与沉淀环面积为座标轴，根据已知的3个抗原浓度与沉淀 环面积绘制曲线。根据曲线和未知浓度抗原的沉淀环面积，可查出其浓度大小。 2.琼脂双向双扩散 (1)将1.2%琼脂用生理盐水溶化，并置于60℃水浴中保温 (2)取3.5毫升溶化的琼脂浇于干净的玻片上，冷却凝周备用。 (3)按图4-1打孔。 (4)封底：将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。 (5)阴阳性定性检测：按图4一1A加样，中央孔加抗原，外周孔1、4加阳性血清，2、 5加阴性血清，3、6加待检血清。 (6)抗体效价测定：按图4一1B,中央孔加抗原，外周孔1一6加入倍比稀释的血清， 每个稀释度加1个孔。 (7)扩散：将玻片放于湿盒中，37℃扩散24小时，观察结果。 (8)结果判定：当阳性血清与抗原孔之间出现明显、致密清晰的沉淀线时，待检血清 与抗原孔形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线末端向邻近待检血清孔偏弯者，此待检血清判 为阳性：待检血清与抗原之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向邻近的待检血清孔直 伸或远离者，此血清判为阴性：抗体效价的判定是以出现阳性反应（明显清晰的沉淀线）的 血清最高稀释度为该血清的琼扩效价。 。8 0 8。 0 00 图4-1琼脂双向双扩散梅花型孔，孔径约3mm,孔距约5mm [作业] 1.每一位学生做一个琼脂双向单扩散，绘制标准曲线，推算出未知抗原浓度。 2.每一位学生做一个琼脂双向双扩散，在阳性及阴性结果正确的情况下，判定待检样 本的阴阳性。 3.回答问题：
4 （8）结果记录：用尺量取沉淀环半径（直径除 2），计算各环面积。 （9）绘制曲线：以抗原浓度与沉淀环面积为座标轴，根据已知的 3 个抗原浓度与沉淀 环面积绘制曲线。根据曲线和未知浓度抗原的沉淀环面积，可查出其浓度大小。 2．琼脂双向双扩散 （1）将 1.2％琼脂用生理盐水溶化，并置于 60ºC 水浴中保温。 （2）取 3.5 毫升溶化的琼脂浇于干净的玻片上，冷却凝固备用。 （3）按图 4－1 打孔。 （4）封底：将琼脂板的无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻灼烧，用手背感觉微烫即可。 （5）阴阳性定性检测：按图 4－1A 加样，中央孔加抗原，外周孔 1、4 加阳性血清，2、 5 加阴性血清，3、6 加待检血清。 （6）抗体效价测定：按图 4－1B，中央孔加抗原，外周孔 1－6 加入倍比稀释的血清， 每个稀释度加 1 个孔。 （7）扩散：将玻片放于湿盒中，37ºC 扩散 24 小时，观察结果。 （8）结果判定：当阳性血清与抗原孔之间出现明显、致密清晰的沉淀线时，待检血清 与抗原孔形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线末端向邻近待检血清孔偏弯者，此待检血清判 为阳性；待检血清与抗原之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向邻近的待检血清孔直 伸或远离者，此血清判为阴性；抗体效价的判定是以出现阳性反应（明显清晰的沉淀线）的 血清最高稀释度为该血清的琼扩效价。 图 4－1 琼脂双向双扩散梅花型孔，孔径约 3mm，孔距约 5mm [作业] 1．每一位学生做一个琼脂双向单扩散，绘制标准曲线，推算出未知抗原浓度。 2．每一位学生做一个琼脂双向双扩散，在阳性及阴性结果正确的情况下，判定待检样 本的阴阳性。 3．回答问题：