实训指导书 实验一 光学显微撞的操作及细菌、放线菌和 蓝细菌个体形态的观察 一、目的 (一)掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 (二)观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二、显微镜的结构、光学原理及其操作方法 (一)显微镜的结构（实验图一1）和光学原理 显微镜分机械装置和光学系统两部分。 1.机械装置 (1)镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。单 筒有直立式（长度为160mm)和后倾斜式（倾斜45）。双简全是倾斜式的，其 中一个筒有屈光度调节装置，以备两眼视力不同者调节使用。两筒之间可调距离， 以适应两眼宽度 不同者调节使用 (2)转换器：转换器装在镜简的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个 孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。 实验图一1显微镜的结构 (3)载物台：载物台为方形（多数）和圆形的平台，中央有一光孔，孔的 两侧各装1个夹片，载物台上还有移动器（其上有刻度标尺），可纵向和横向移 动，移动器的作用是夹住和移动标本用。 (4)镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活 动式（可改变倾斜度）两种。 (5)镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。 (6)调节器：调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物 镜和所需观察的物体之间的距离 ,调节 器有装在镜臀上方或下方的两种，装在镜 臂上方的是通过升降镜臂来调焦距，装在镜臂下方的是通过升降载物台来调焦 距，新式显微镜多半装在镜臂的下方。 2、光学系统及其光学原理 （1)目镜：每台显微镜备有3个不同规格的目镜，例如，5倍(5×)、10 倍(10×)和15倍(15×)，高级显微镜除了上述三种外，还有20倍(20× 的。 (2)物镜：物镜装在转换器的孔上，物镜有低倍(8×、10×、20×三种)、 高倍(40×或45×)及油镜(10X)。物镜的性能由数值孔径(Numerical Aperture,.N,A.)决定，数值孔径=n·sina/2,其意为玻片和物镜之间的折 射率乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正 光线投射到物镜的角度越 大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。是影响数值 孔径的因素，空气的折射率n=1,水的折射率n=1.33,香柏油的折射率n=1.52, 用油镜时光线入射a/2为60°，则sin60=0.87。从实验图一2可知： 以空气为个质时：N.A.=1X0.87三0.87 以水为介质时： N.A.=1.33×0.87=1.16 以香柏油为介质时： 1.52y 0.87= .32 显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率即能分辨两点之间的最小距离的能
力。分辨率用8表示， 6=0.61×入/.A.(入为波长)，分辨率与数值孔径城 正比，与波长成反比。增大数值孔径，缩短波长可提高显微镜的分辨率，使日的 物的细微结构更清晰可见。事实上可见光的波长(0.38~0.7μm)是不可能缩短 的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。 物错上标右.NA125.100× 01”、160/017、016等字样 其中NA 1.25为数值孔径， 100×为放大倍数 160/0.17”中160表示镜 简长，0.17表示要求盖玻片的厚度。“0I”表示油镜，（即Oi1 Imnersion), 0.16为工作距离。 显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。 (3)聚光器：聚光器安装在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光 器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可 下调节，它中间装有光圈可调节光亮度，在看高倍镜和油镜时需调节聚光器，合 理调节聚光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。 (4)反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面 镜，光源为灯光时用凹面镜。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。 (5)滤光片：自然光由各种波长的光组成，如只需某一波长的光线，可选 用合适的滤光片 以提高分辨 ,增加反差和清晰 滤光片有紫、青、蓝、绿、 黄、橙、红等颜色。根据标本颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 (二)显微镜的操作方法 1.低倍镜的操作 (1)置品倍干固定的卓上。窗外不宣有暗得视线之物 (2)旋动转换器， 将低倍镜移到镜筒】 )转动反光前石光驱处，同时用眼对准目皖对适当政大倍数的霜 镜)仔细观察，使视野亮度均匀。 (4)将标本片成在我物台上，使观察的目的物置于圆孔的正中央 (5)将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜，以防物 镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5©m处时停止旋转 (6)左眼向目镜里观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十 分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。 (7)如果粗调节器旋得太快，使超过焦点，必须从第(5)步重调，不应正 视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。 (8)观察时两眼同时睁开（双眼不感披劳）。单筒显微镜应习惯用左眼观 以便于 会图 2.高倍镜的操作 (1)使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正中处 (2)旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原 来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了， 换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见， 3.油镜的操作 (1)如果用高倍镜目的物末能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查 标本片，将目的物移到视野正中。 (2)在载玻片上滴一演香柏油（或液体石蜡），将油镜移至正中使油镜头 浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调（切记不用粗调节器）即 可】
(3)油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油揩净，另用擦镜纸蘸少许二甲 苯搭拭镜头，再用擦镜纸揩干。 (三)目测微尺、物测微尺及其使用方法 1.目测微尺 耳测激尺是一圆形破片，其中央刻有5mm长的、第分为50格（或100热） 的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数及镜简长度而定。使用前用物 测微尺标定，用时放在目镜内。 2.物测微尺 物测微尺是一厚玻片，中央有一圆形盖玻片，中央刻有1m长的标尺，等分 为100格，每格为10μm,用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。 3.目测微尺的标定 将目测做尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下：把物测微尺放在载物台上使刻 度朝上。用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第 条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。例如实验图一3④中A(目测微尺)上5 格对准B物测微尺上的 2格，B的 格为】 2格的长度为20 测微尺上1小格的长度为4μm,再分别求出高倍镜和油镜下目测微尺每格的长 度。 4.南体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物的大小，分别找 出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出菌体的长度和 宽度。 三、细菌、放线菌及蓝细菌的个体形态观察 (一)仪器和材料 1.显微镜、擦镜纸、香柏油或液体石蜡、二甲苯 示范片 大肠杆菌（杆状 小球菌（球形） 硫酸盐还原菌（弧形） 浮游球衣菌（丝状）、枯草芽抱杆菌、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颜藻、鱼 腥藻或念味藻。 (二实验内容和操作方法 1,严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序逐个观察杆 状、球状、弧状及丝状的细菌示范片，用铅笔分别绘出各种细南的形态图。 2,同法逐个观察放线菌的示范片 绘出其形态图。 3。同法逐个观察雪颤漠、鱼腥桑或念珠漠，绘出其形态图。 思考题 1.使用油镜为什么要先用低倍和高倍镜检查？ ※<标题二> 实验二微生物细胞数的计数
一、目的 了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。 二、仪器与材料 显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液（不用酵母菌，改用其他微生物作 材料亦可) 三、血球计数板的结构与计算方法 血求计板（实验图一5)是一快比普通载破片厚的特制破片。破片中央刻 有四条 中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的两边的 平面上各刻有9个大方格。中间的一 个大方格为计数室，它的长和宽各为1mm, 深度为0.1m,其体积为0.1mm'。计数室有两种规格：一种是把大方格分成16 中格，每一中格分成25小格，共400小格：另一种规格是把一大方格分成25 中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下： 16×25的计数板计算公式 细胞数/ml= (100小格内的细胞数/100)×400×1000×稀释倍数 2、25×16的计数板计算公式 细胞数/mL=(80小格内的细胞数/80)×400×1000×稀释倍数 四、操作步骤 (一）稀释样品 为了便于计数 将样品适当稀释，使每格约含5个细胞 )取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取 少许充分摇匀的待测南液于盖玻片的边缘，南液则自行渗入计数室，静置5一 10min即可计数。 (一)将血球补数板智千截物台上，用低倍箭找到小方格网后换高倍箭观察 计数。需不断地上 下旋动细调节器，以便看到计数室内不同深度的茵体。现以 16×25规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下 的四中格（即 100小格)的酵母菌数。如果是25×16规格的计数板，除取四个角上四中格外， 还取正中的一个中格（即80小格），对位于大格线上的酵母南只计大格的上方 及左方线上的酵母菌，或只计下方及右方线上的酵母菌。 每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母 南 思考题 为什么用两种不同规格的计数板测同一样品时，其结果一样？ ※<标题三> 实验三微生物的染色 一、目的
学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一股染色 法和革兰氏染色法。 二、染色原理 微牛吻（尤其是细菊）的机体是无色诱明的，在显教增下，由干光源是自然 光，使微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构，若增加其反差 微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生 物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液 中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。经测 定，细菌等电点在pH2~5之间，故细菌在中性(pH7)、碱性(pH>7)或偏 酸性(pH6 7)的溶液中，细菌 电点均 于上述溶液的H值，所以细菌带 负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的为多。碱性染料 有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红等。 微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结 构以便观察。 三、染色方法有简单染色法和复染色法之分 (一)简单染色法 简单染色法又叫普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在 显微镜下看清细南的形态，用简单染色即可。 (二)复染色法 用两种 多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴 染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。抗酸性染色法多在医 学上采用。此处介绍革兰氏染色法。 革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性南两大类。它的染色步骤如下：先用草酸铵结晶紫染色 经碘一碘化钾（媒染剂）处理后用乙醇脱色， 最后用蓄红液复染 如果细 菌能保 持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被乙醇脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色者叫革 兰氏阳性菌。被乙醇脱色用蕃红液复染后呈红色者为革兰氏阴性菊。 四、仪器和材料 一)显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环 载玻片、酒精灯（或煤气灯） 二)石炭酸复红（品红）染液、草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、 蕃红染液 (三)菌种：枯草杆菌、大肠杆菌 五、实验内容和步骤 ·)细菌的简单染色步骤 1,涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号并滴一滴无菌蒸馏水于载 玻片的中央，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从叙面挑取少量菌种（大肠杆菌 或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布血