D01:10.13374j.isml00103x2006.06.004 第28卷第6期 北京科技大学学报 Vol.28 Na 6 2006年6月 Journal of University of Science and Technology Beijing Jum.2006 Geobacter metallireducens异化还原 铁氧化物三种方式 冯雅丽D 周良2》祝学远)连 静D 李少华2) 1)北京科技大学土木与环境工程学院北京100083 2)中国科学院研究生院中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京100⑧0 摘要异化金属还原菌通过络和剂、电子传递中间体、直接接触三种方式异化还原金属氧化矿. 以Geobacter metallireducens还原铁氧化物为实验体系，利用微生物燃料电池考察了以上三种方式 对异化还原铁氧化物的影响.结果表明.微生物异化还原铁氧化矿时，NTA,AQDS在初始阶段显 著加速铁氧化物的还原但也加速磁铁矿的生成，阻碍反应继续进行：直接接触方式起着重要作 用.吸附形成的生物膜是一个关键因素，其形成是一个相对较长的过程.生物膜的形成阻碍电子传 递中间体发挥作用. 关键词铁氧化物：铁还原，异化金属还原菌：微生物燃料电池 分类号Q93 微生物异化还原金属氧化矿的过程是在土 可作为细胞的最终电子受体，在微生物细胞外膜 壤、河海中广泛存在的一个重要的生物及地球化 上得到还原酶的电子被还原，然后成还原态的分 学过程，深刻地影响着这些环境中地球化学元素 子扩散到金属氧化矿表面，将金属氧化矿还原，同 的组成、分布以及矿物学形态.因为该过程耦联 时自身回复到原来的氧化态分子.这种电子传递 了高价态金属元素的还原与有机物的氧化降解 中间体可以多次使用，就像一个运输电子的运输 己逐渐广泛应用于生物治金、重金属离子（铀，铬， 工具，在细胞外膜装载电子，运送到金属氧化物表 钒等)污染的生物治理1)以及石化类有机污水 面时卸载下电子给予金属氧化矿，然后继续下一 的生物降解4 轮的转载.(3)直接吸附接触后传递电子. 这一过程的主要特征是微生物利用固态的金 Childers等1g发现Gecbacter metallireducens异 属氧化矿作为其呼吸作用的最终电子受体.微生 化还原金属离子时，以Fe(OH)3和MnO2为电子 物采取三种方式将位于细胞外膜的还原型细胞色 受体时，细胞会产生鞭毛、菌毛这类附属物.细胞 素上累积的电子传递给固体氧化矿物：(1)通过络 能够借助鞭毛游动趋近金属氧化物表面并依靠菌 和剂络和金属离子成游离状态.Lovy等9在利 毛紧密吸附到金属氧化物表面.Mehta等在对 用DMB处理含水溶性芳香族化合物的石油污 Geobacter sulfurreducens的菌毛开展的研究中发 染时，发现在实验体系中增加一种Fe的络和剂 现剔除控制生成菌毛蛋白的相关基因，细胞丧失 一氨三乙酸(NTA),显著加速了芳香族化合物 异化还原固态电子受体Fe(OH)3,MnO2的能力， 的氧化降解甚至苯、甲苯这些通过普通的通氧气 但是仍具有还原Fe3+络和物Fe+一NTA的能 很难氧化降解的都能相对迅速地彻底氧化成二氧 力.这些实验虽然不能表明以鞭毛、菌毛作为介 化碳.(2)游离的电子传递中间体在细胞和固体 体的直接接触吸附是异化还原金属氧化物的必备 的金属氧化矿之间传递电子9.所谓电子传递 条件，但可以看出接触吸附与异化还原金属氧化 物之间是有密切联系的 中间体是一种能够介入异化还原体系，起电子运 铁元素是地球上最丰富的金属元素，而且铁 输载体作用的小分子，这类分子处于氧化态时， 的氧化矿物在自然界中以各式各样的形式普遍存 收稿日期：2005-04-05修回日期：3006-03-10 在，所以微生物异化还原铁氧化矿是一个非常重 基金项目：国家自然科学基金资助项目(Na.20476009:No. 要的金属氧化矿还原的过程.本文即以Gobac- 20576137)及国家973”资助项目(Na2003CB716001) 作者简介：冯雅丽(1967一)，女，副散授博士 ter metallireducens还原铁氧化物为基本实验体
Geobacter metallireducens 异化还原 铁氧化物三种方式 冯雅丽 1) 周 良 2) 祝学远 1) 连 静 1) 李少华 2) 1)北京科技大学土木与环境工程学院, 北京 100083 2)中国科学院研究生院, 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室, 北京 100080 摘 要 异化金属还原菌通过络和剂、电子传递中间体、直接接触三种方式异化还原金属氧化矿. 以 Geobacter metallireducens 还原铁氧化物为实验体系, 利用微生物燃料电池考察了以上三种方式 对异化还原铁氧化物的影响.结果表明, 微生物异化还原铁氧化矿时, NTA , AQDS 在初始阶段显 著加速铁氧化物的还原, 但也加速磁铁矿的生成, 阻碍反应继续进行;直接接触方式起着重要作 用, 吸附形成的生物膜是一个关键因素, 其形成是一个相对较长的过程.生物膜的形成阻碍电子传 递中间体发挥作用. 关键词 铁氧化物;铁还原;异化金属还原菌;微生物燃料电池 分类号 Q 93 收稿日期:2005 04 05 修回日期:2006 03 10 基金项目:国家自然科学 基金资助项目(No .20476009;No . 20576137)及国家“ 973”资助项目(No.2003CB716001) 作者简介:冯雅丽(1967—), 女, 副教授, 博士 微生物异化还原金属氧化矿的过程是在土 壤、河海中广泛存在的一个重要的生物及地球化 学过程 ,深刻地影响着这些环境中地球化学元素 的组成、分布以及矿物学形态 .因为该过程耦联 了高价态金属元素的还原与有机物的氧化降解, 已逐渐广泛应用于生物冶金、重金属离子(铀 ,铬, 钒等)污染的生物治理[ 1 3] 以及石化类有机污水 的生物降解 [ 4 5] . 这一过程的主要特征是微生物利用固态的金 属氧化矿作为其呼吸作用的最终电子受体.微生 物采取三种方式将位于细胞外膜的还原型细胞色 素上累积的电子传递给固体氧化矿物:(1)通过络 和剂络和金属离子成游离状态 .Lovely 等[ 6] 在利 用 DM RB 处理含水溶性芳香族化合物的石油污 染时 ,发现在实验体系中增加一种 Fe 2+的络和剂 ———氨三乙酸(NTA), 显著加速了芳香族化合物 的氧化降解,甚至苯 、甲苯这些通过普通的通氧气 很难氧化降解的都能相对迅速地彻底氧化成二氧 化碳 .(2)游离的电子传递中间体在细胞和固体 的金属氧化矿之间传递电子[ 7 9] .所谓电子传递 中间体是一种能够介入异化还原体系 , 起电子运 输载体作用的小分子 .这类分子处于氧化态时, 可作为细胞的最终电子受体, 在微生物细胞外膜 上得到还原酶的电子被还原, 然后成还原态的分 子扩散到金属氧化矿表面 ,将金属氧化矿还原,同 时自身回复到原来的氧化态分子 .这种电子传递 中间体可以多次使用 , 就像一个运输电子的运输 工具 ,在细胞外膜装载电子,运送到金属氧化物表 面时卸载下电子给予金属氧化矿, 然后继续下一 轮的转 载.(3)直接吸 附接触 后传递 电子. Childers 等[ 10] 发现 Geobacter metallireducens 异 化还原金属离子时 ,以 Fe(OH)3 和 M nO2 为电子 受体时 ,细胞会产生鞭毛、菌毛这类附属物 .细胞 能够借助鞭毛游动趋近金属氧化物表面并依靠菌 毛紧密吸附到金属氧化物表面.Mehta 等在对 Geobacter sulfurreducens 的菌毛开展的研究中发 现,剔除控制生成菌毛蛋白的相关基因 ,细胞丧失 异化还原固态电子受体 Fe(OH)3 , MnO2 的能力, 但是仍具有还原 Fe 3 +络和物 Fe 3 +—NTA 的能 力.这些实验虽然不能表明以鞭毛 、菌毛作为介 体的直接接触吸附是异化还原金属氧化物的必备 条件, 但可以看出接触吸附与异化还原金属氧化 物之间是有密切联系的. 铁元素是地球上最丰富的金属元素, 而且铁 的氧化矿物在自然界中以各式各样的形式普遍存 在,所以微生物异化还原铁氧化矿是一个非常重 要的金属氧化矿还原的过程 .本文即以 Geobacter metallireducens 还原铁氧化物为基本实验体 第 28 卷 第 6 期 2006 年 6 月 北 京 科 技 大 学 学 报 Journal of University of Science and Technology Beijing Vol .28 No.6 Jun.2006 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2006.06.004
Vol.28 No.6 冯雅丽等：Geobacter metallireducens异化还原铁氧化物三种方式 525· 系，分别考察以上三种方式对异化还原铁氧化物 能的干扰，将细胞从以Fe(OH)方作电子受体的培 的影响.同时为了更准确、细致地研究异化还原 养基中转入以富马酸钠作电子受体的培养基培 过程中以直接接触的方式进行电子传递，设计了 养4代后，取对数生长期后期菌液按10%接种入 一套微生物燃料电池体系，让电池的阳极石墨棒 阳极室 代替铁氧化物做微生物的电子受体. 该电池体系中阳极石墨电极是固态的最终电 子受体，细胞失去电子给阳极石墨电极，电子经阳 1实验材料和方法 极石墨棒，再通过外电路后最终在阴极还原溶解 1.1菌种及其培养条件 氧.上述过程与细胞失去电子给铁氧化矿等固态 Geobacter metallireducens来自德国菌种保 电子受体是类似的过程，且微生物燃料电池体系 藏中心(DSMZ7210,ATCC53774).培养基成分 不仅能克服Fe(OH)3还原培养体系中还原生成 (1 L):KC1 0.1g,NH4C1 0.2g,NaH2PO40.6g, 的Fe+离子沉积生成磁铁矿这一干扰因素，而且 NaHCO32.5g,Wolfe微量维生素混合液、微量矿 氧化还原速率可以直接通过外电路电流记录，能 物元素混合液各10mL(具体可参见美国菌种库 更准确，迅速地反映出微生物将电子传递给固态 ATCC的第I768号培养溶液)，电子供体NaAc 电子受体的过程. 10 mmol'L1,调pH6.8~7.0.利用N2一C02 13分析方法及数据采集设备 (8020,体积比)除去灭菌前培养基中的氧气后， Fe2+及Fe升浓度的测定：Ferrozne法 分装入厌养培养管中，121℃灭菌15minm,在厌养 电流采集：数据采集卡瑞博华AD8201H,16 培养箱进行必要的转接等操作，整个过程严格厌 位，32通道，编程双端方式工作，采集精度为 养培养.电子受体Fe(OH)3,由FcCl3与NaOH 01mV. 反应生成，洗涤除去残留的盐离子后，自然干燥 取100 m mol'L1灭菌后加入培养基中.其他可 2实验结果与讨论 选的最终电子受体富马酸钠、Fe的络和物Fe一 2.1络和剂对Geobacter metallireducens异化还 NTA(氨三乙酸)、电子传递中间体AQDS(9,10- 原Fe(OH)3速率的影响 蒽醌-2,6磺酸钠)均须过滤灭菌后加入.培养温 Fe3+络和剂，如NTA,通过直接弱化铁的氧 度30℃. 化物表面的Fe一O键，降低了直接吸附接触后异 12微生物燃料电池体系1-3 化还原的能垒，同时扩展微生物可还原金属氧化 微生物燃料电池由阴极、阳极两个电极室构 物矿的晶体类别：络和剂的加入，使之形成可溶 成，阴极浸没在饱含氧气的溶液中（阴极室，阳极 的游离的Fe升络和物，消除、降低直接吸附接触 浸没在厌养环境下的培养基中（阳极室），通过质 还原的必要，这个过程同时会将不规则颗粒空隙 子交换膜连接(Nafio一II7,Dupont),每个电极 内部，不可能被细胞通过直接接触异化还原也络 室装入溶液体积250mL.电极均为不抛光高纯石 和溶解出来，提高还原率.实验选择Fe3+的络和 墨电极.物理表面积75cm2,使用前用1molL1 剂NTA(氨三乙酸)来考察络和剂对微生物异化 HCI浸泡去处杂质离子，用完后再用1.0molL1 还原Fe(OH)3速率的影响. 的NaOH浸泡以除去其表面吸附的细胞.阳极接 实验结果如图1所示.结果表明加入络和剂 种细菌，接种前通N2一C02(8020,体积比)混合 NTA能短时间内极大地提高Fe2+的生成速率 气除尽装入的培养基的氧气，接种后密封或者缓 说明合适的金属离子络和剂可提高微生物异化还 慢通混合气.阴极持续通空气，保持其内溶解氧 原Fe(OH)3的速率. 的浓度.两极室均缓慢搅拌.阴极、阳极室的溶 以上的实验结果与文献报道的结果相符合， 液.其成分与培养基只有如下三处不同：(1)阴极 但是对于加入NTA的长时间作用后Fe(OH3异 需要用pH7.0的Tic-HCl做缓冲溶液，阳极继 化还原的结果却很少有文献报道.相关实验的结 续用NaHC03的缓冲体系；(2)各极均含电解质 果如图2.图2表明，5d以后，没有加入络和剂 NaCl2.9gL;(3)阴极不加电子供体，阳极需 NTA的体系，同样达到了很高的异化还原速率， 要加入电子供体（燃料）NaAc,一般阳极室内其初 并且之后一直保持稳定，而加入络和剂NTA的 始浓度为1 mmol 'L1.外电阻不做特别变动为 体系，异化还原速率则开始下降.30d后，两者的 5102.为了除去Fe+或Fe+离子对电极反应可 还原产物Fe2+的量差别不大
系,分别考察以上三种方式对异化还原铁氧化物 的影响.同时为了更准确、细致地研究异化还原 过程中以直接接触的方式进行电子传递 ,设计了 一套微生物燃料电池体系 ,让电池的阳极石墨棒 代替铁氧化物做微生物的电子受体 . 1 实验材料和方法 1.1 菌种及其培养条件 Geobacter metallireducens 来自德国菌种保 藏中心(DSMZ 7210 ,ATCC 53774).培养基成分 为(1 L):KCl 0.1 g ,NH4Cl 0.2 g ,NaH2PO4 0.6g , NaHCO3 2.5 g , Wolfe 微量维生素混合液、微量矿 物元素混合液各 10 mL(具体可参见美国菌种库 ATCC 的第 1768 号培养溶液), 电子供体 NaAc 10 mmol·L -1 , 调 pH 6.8 ～ 7.0 .利用 N2 —CO2 (80∶20 ,体积比)除去灭菌前培养基中的氧气后, 分装入厌养培养管中 , 121 ℃灭菌 15 min ,在厌养 培养箱进行必要的转接等操作, 整个过程严格厌 养培养 .电子受体 Fe(OH)3 , 由 FeCl3 与 NaOH 反应生成, 洗涤除去残留的盐离子后, 自然干燥, 取100 mmol·L -1灭菌后加入培养基中 .其他可 选的最终电子受体富马酸钠、Fe 的络和物 Fe— N TA(氨三乙酸)、电子传递中间体 AQDS(9 , 10- 蒽醌-2 , 6-磺酸钠)均须过滤灭菌后加入 .培养温 度 30 ℃. 1.2 微生物燃料电池体系[ 11 13] 微生物燃料电池由阴极、阳极两个电极室构 成,阴极浸没在饱含氧气的溶液中(阴极室), 阳极 浸没在厌养环境下的培养基中(阳极室),通过质 子交换膜连接(Nafion-117 , Dupont), 每个电极 室装入溶液体积250mL .电极均为不抛光高纯石 墨电极 .物理表面积 75 cm 2 ,使用前用 1 mol·L -1 HCl 浸泡去处杂质离子,用完后再用 1.0 mol·L -1 的 NaOH 浸泡以除去其表面吸附的细胞.阳极接 种细菌 ,接种前通 N2 —CO2(80∶20 , 体积比)混合 气除尽装入的培养基的氧气, 接种后密封或者缓 慢通混合气.阴极持续通空气, 保持其内溶解氧 的浓度 .两极室均缓慢搅拌 .阴极 、阳极室的溶 液,其成分与培养基只有如下三处不同:(1)阴极 需要用 pH 7.0 的 Tric-HCl 做缓冲溶液, 阳极继 续用 NaHCO3 的缓冲体系 ;(2)各极均含电解质 NaCl 2.9 g·L -1 ;(3)阴极不加电子供体, 阳极需 要加入电子供体(燃料)NaAc ,一般阳极室内其初 始浓度为 1 mmol·L -1 .外电阻不做特别变动为 510 Ψ.为了除去 Fe 2 +或 Fe 3+离子对电极反应可 能的干扰 ,将细胞从以 Fe(OH)3 作电子受体的培 养基中转入以富马酸钠作电子受体的培养基, 培 养 4 代后 ,取对数生长期后期菌液按 10 %接种入 阳极室. 该电池体系中阳极石墨电极是固态的最终电 子受体,细胞失去电子给阳极石墨电极 ,电子经阳 极石墨棒, 再通过外电路后最终在阴极还原溶解 氧.上述过程与细胞失去电子给铁氧化矿等固态 电子受体是类似的过程 ,且微生物燃料电池体系 不仅能克服 Fe(OH)3 还原培养体系中还原生成 的 Fe 2 +离子沉积生成磁铁矿这一干扰因素 ,而且 氧化还原速率可以直接通过外电路电流记录, 能 更准确 、迅速地反映出微生物将电子传递给固态 电子受体的过程. 1.3 分析方法及数据采集设备 Fe 2 +及 Fe 3+浓度的测定:Ferrozine 法. 电流采集:数据采集卡瑞博华 AD8201H , 16 位, 32 通道, 编程双端方式工作, 采集精度为 0.1 mV . 2 实验结果与讨论 2.1 络和剂对 Geobacter metallireducens 异化还 原 Fe(OH)3 速率的影响 Fe 3 +络和剂, 如 NTA , 通过直接弱化铁的氧 化物表面的 Fe—O 键, 降低了直接吸附接触后异 化还原的能垒, 同时扩展微生物可还原金属氧化 物矿的晶体类别 ;络和剂的加入, 使之形成可溶 的游离的 Fe 3+络和物 , 消除 、降低直接吸附接触 还原的必要 ,这个过程同时会将不规则颗粒空隙 内部, 不可能被细胞通过直接接触异化还原也络 和溶解出来 ,提高还原率 .实验选择 Fe 3 +的络和 剂N TA(氨三乙酸)来考察络和剂对微生物异化 还原 Fe(OH)3 速率的影响. 实验结果如图 1 所示 .结果表明加入络和剂 NTA 能短时间内极大地提高 Fe 2+的生成速率, 说明合适的金属离子络和剂可提高微生物异化还 原 Fe(OH)3 的速率. 以上的实验结果与文献报道的结果相符合, 但是对于加入 NTA 的长时间作用后 Fe(OH)3 异 化还原的结果却很少有文献报道 .相关实验的结 果如图 2 .图 2 表明, 5 d 以后 , 没有加入络和剂 NTA 的体系 ,同样达到了很高的异化还原速率, 并且之后一直保持稳定 , 而加入络和剂 N TA 的 体系 ,异化还原速率则开始下降 .30 d 后, 两者的 还原产物 Fe 2+的量差别不大 . Vol.28 No.6 冯雅丽等:Geobacter metallireducens 异化还原铁氧化物三种方式 · 525 ·
。526· 北京科技大学学报 2006年第6期 于可溶的电子受体，而络和剂一定程度上可在反 4.0 应初期加速该过程，但针对Fe(OH)3这类存在还 3.5 3.0 原离子干扰的固体电子受体，络和剂长期作用效 2.5 果不大.而直接异化还原却需要一个较长的时间 2.0 △-Fe(OH),培养基中无NTA 才能达到一个稳定的异化还原速率.从实际应用 1.5 ◆一Fe(OH),培养5中m人 4 mmol L-NTA 的角度，在生物环境整治或其他工程应用中，利用 1.0 NTA和EDTA这类络和剂来提高固体电子受体 0.5 的生物可及性从而提高反应速率的方法可行性不 2 时间h 大：这是因为NTA和EDTA同样会络和铜、钴、 镍等其他金属元素，造成这类污染元素的扩散. 图1络和剂NTA对Geobacter metallired iences异化还原Fe (OH),(100 mmol-L-)速率的影响.接种时带入的e+在各 所以需要在自然界中寻找天然存在的合适的有机 点数据已截去 物作络和剂或其他方式. Fig.1 Production of Fe by Geobacter metallireduaences from 2.2电子传递中间体对Geobacter metallire- Fe(OH)(100 mmol-L)with or without NTA as chelator.The ducens异化还原Fe(OH3速率的影响 results are the means of triplicate determinations.Initial Fe2+ 腐殖酸、各种蒽醌类化合物、含硫醇分子、半 bought in by inocu ation had been subtracted. 胱氨酸、黑色素等都具有电子传递中间体的能力. 在金属氧化物异化还原作用中，发现它们可以在 20 -■-Fc(OH),培养基中无NTA 厌氧环境中，作微生物氧化有机物或氢气的电子 。-Fe(OH,培养些中l入p- 4 mmolL NTA 受体，同时也可以作电子传递中间体，在细胞外膜 15 还原酶和金属氧化物间起传递电子的桥梁作用， 10 加速金属氧化物异化还原.实验选用AQDS(9,10 5 一蒽醌一2,6磺酸钠)研究电子传递中间体对 Geobacter metallireducens异化还原Fe(OH)3速 率的影响. 10152025 30 时fd 如图3所示，接种后的短时间内，AQDS可以 明显加速的Fe(OH3还原.具体反应过程可用 图2络和剂NTA对Fe(OH)3(100mmdLˉ1)异化还原结果 如下反应式表示： 的影响（长时间内） Gecbacter metallired ucens Fig.2 Comparison of the reduction of Fe(OH)3(100 mmal Fe(OH)3+CH3COOH L)with and without NTA in a long term Fe2++C02(慢)， 反应进行一段时间后，在实验中检测到类似 AQDSCHCOOH-Caobacter malliradems Fes04黑色顺磁性的物质，该物质不能被Geobac- AHQDS+C02(快)， ter metallireducences继续异化还原.原因是还原 AHQDS+Fe(OH)3-AQDS++Fe2 ) 形成的Fe+离子会与沉积在Fe(OH)3颗粒表面 二次成矿形成一种类似Fe3O4黑色顺磁性的物 长时间观察，AQDS对加速异化还原的效果 质，覆盖在Fe(OH)3颗粒的表面，阻止细胞对 则不明显测定的结果如图4.同样是由于 Fe(OH)3颗粒的进一步还原同时大量的Fe2+离 Fe(OH)3还原体系中Fe3O4黑色顺磁性物质，覆 子会沉积在细胞外壁，降低细胞的活性 盖在Fe(OH)3颗粒表面，阻止细胞对Fe(OH)3 后续微生物电池的实验证实，不加入NTA 颗粒的进一步还原.而在不加入AQDS的培养基 的直接还原Fe(OH)3体系之所以需要5d后才能 中，随着细胞的缓慢生长，吸附在颗粒表面，还原 达到稳定的较高速率，是因为直接在Fe(OH方颗 速率逐渐提高，Fe+同步生成，于是生成Fe304的 粒表面发生的异化还原反应需要很多细胞慢慢地 速度也较慢，但同样只能还原一部分Fe(OH)3. 不断在颗粒表面吸附，形成一个成熟的生物膜后 因为Fe(OH)3颗粒太小，而且多了一个阻滞 还原速率就能达到稳定 Fe(OH)3还原的干扰因素，给进一步的研究直接 以上实验证实了固体电子受体的传递阻力大 吸附接触还原Fe(OH)3方式带来困难
图 1 络和剂 NTA 对 Geobacter metallired ucences 异化还原 Fe (OH)3(100 mmol·L -1)速率的影响.接种时带入的 Fe 2+在各 点数据已截去. Fig.1 Production of Fe 2 +by Geobacter metallireducences from Fe(OH)3(100 mmol·L -1)with or without NTA as chelator.The results are the means of triplicate determinations.Initial Fe 2 + bought in by inoculation had been subtracted. 图 2 络和剂 NTA 对 Fe(OH)3(100 mmol·L -1)异化还原结果 的影响(长时间内) Fig.2 Comparison of the reduction of Fe(OH)3(100 mmol· L -1)with and without NTA in a long term 反应进行一段时间后, 在实验中检测到类似 Fe3O4 黑色顺磁性的物质 ,该物质不能被 Geobacter metallireducences 继续异化还原.原因是还原 形成的 Fe 2 +离子会与沉积在 Fe(OH)3 颗粒表面 二次成矿形成一种类似 Fe3O4 黑色顺磁性的物 质,覆盖在 Fe(OH)3 颗粒的表面 , 阻止细胞对 Fe(OH)3 颗粒的进一步还原,同时大量的 Fe 2 +离 子会沉积在细胞外壁 ,降低细胞的活性 . 后续微生物电池的实验证实, 不加入 N TA 的直接还原 Fe(OH)3 体系之所以需要 5 d 后才能 达到稳定的较高速率 ,是因为直接在 Fe(OH)3 颗 粒表面发生的异化还原反应需要很多细胞慢慢地 不断在颗粒表面吸附 , 形成一个成熟的生物膜后 还原速率就能达到稳定. 以上实验证实了固体电子受体的传递阻力大 于可溶的电子受体 , 而络和剂一定程度上可在反 应初期加速该过程, 但针对 Fe(OH)3 这类存在还 原离子干扰的固体电子受体, 络和剂长期作用效 果不大.而直接异化还原却需要一个较长的时间 才能达到一个稳定的异化还原速率 .从实际应用 的角度,在生物环境整治或其他工程应用中 ,利用 NTA 和 EDTA 这类络和剂来提高固体电子受体 的生物可及性从而提高反应速率的方法可行性不 大;这是因为 N TA 和 EDTA 同样会络和铜 、钴、 镍等其他金属元素, 造成这类污染元素的扩散. 所以需要在自然界中寻找天然存在的合适的有机 物作络和剂或其他方式. 2.2 电子传 递中间 体对 Geobacter metallireducens 异化还原 Fe(OH)3 速率的影响 腐殖酸 、各种蒽醌类化合物、含硫醇分子、半 胱氨酸、黑色素等都具有电子传递中间体的能力. 在金属氧化物异化还原作用中, 发现它们可以在 厌氧环境中 ,作微生物氧化有机物或氢气的电子 受体 ,同时也可以作电子传递中间体,在细胞外膜 还原酶和金属氧化物间起传递电子的桥梁作用, 加速金属氧化物异化还原 .实验选用 AQDS(9 , 10 -蒽醌-2 , 6-磺酸钠)研究电子传递中间体对 Geobacter metallireducens 异化还原 Fe(OH)3 速 率的影响 . 如图 3 所示,接种后的短时间内,AQDS 可以 明显加速的 Fe(OH)3 还原.具体反应过程可用 如下反应式表示: Fe(OH)3 +CH3COOH - Geobacter metallired ucens Fe 2 ++CO2(慢), AQDS +CH3COOH - Ceobacter metallired ucens AHQDS +CO2(快), AHQDS +Fe(OH)3 AQDS +Fe 2 +(快). 长时间观察, AQDS 对加速异化还原的效果 则不 明显, 测定 的结 果如图 4 .同样是 由于 Fe(OH)3还原体系中 Fe3O4 黑色顺磁性物质, 覆 盖在 Fe(OH)3 颗粒表面, 阻止细胞对 Fe(OH)3 颗粒的进一步还原.而在不加入 AQDS 的培养基 中,随着细胞的缓慢生长, 吸附在颗粒表面 ,还原 速率逐渐提高 , Fe 2 +同步生成,于是生成 Fe3O4 的 速度也较慢,但同样只能还原一部分 Fe(OH)3 . 因为 Fe(OH)3 颗粒太小 ,而且多了一个阻滞 Fe(OH)3还原的干扰因素, 给进一步的研究直接 吸附接触还原 Fe(OH)3 方式带来困难 . · 526 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2006 年第 6 期
Vol.28 No.6 冯雅丽等：Geobacter metallireducens异化还原铁氧化物三种方式 ·527 Goluder.mealkredcens 2.5m CH3000+2H20 2002+7H+8e. 阴极：02十4e十4H2H20 2.0 其中，阳极室产生的H+通过质子交换膜可以达 1.5 到阴极室，与还原的氧反应生成水. 1.0 O-无AQDS 该电池体系中，外电阻通过的电流直接反应 -■-加人50μ4molL-1AQDS 色05 了异化还原的速率，也即细胞失去电子给予固态 电子受体的速率 由图5可知，从零时刻接种到电流达到一个 时时/h 稳定的平台，需要一个较长的时间. 图3AQDS对Geobacter metallired wens异化还原Fe(OH方 0.5 (100mmoL-1)速率的影响 Fig.3 Effect of AQDS on the dissimilatory reduction of Fe 0.4 (OH)3(100mmol-L1) .3 02 16 14 -·一无AQDS 12 -o-m人50μmol-L-AQDS 10 2000 4000 6000 8 时间min 6 图5微生物燃料电池零时刻接种细胞(10%)后电流的变化 (a)AQDS50μmol(b)无AQDS 2 Fig.5 Electron transfer in a microbial fuel cell by Geobacter 0 metallireducens.In the microbial fuel cell.graphite electrode 5 10 20 时间/d was served as sole electron acceptor.acetate as electron donor. 10%inoculum:(a)50mol AQDS (b)without AQDS 图4AQDS对Gecbacter metallired ucens异化还原Fe(OH3 (100mmoL一1)速率的影响（长时间内） 如图6所示，若电池长时间反应后，用新的含 Fig.4 Effect of AQDS on the dissimilatory redution of Fe 醋酸盐的培养基替换阳极溶液，保留原来的电极， (OH)3(100mmol-L)in a long term 不仅不需要再接种细胞，而且可以迅速达到原来 2.3微生物直接吸附传递电子予固体电子受体 的电子传递速率 为了消除干扰因素，更直接、准确地研究 0.5 换培养基 Gebacter metallireducens利用直接吸附进行胞 0.4 外电子传递从而异化还原电子受体的方式，利用 微生物燃料电池体系，以阳极石墨棒替代Fε(OH)3 固体颗粒作电子受体来研究这一直接吸附接触异 0.2 化还原方式.先用Fe(OH3作最终电子受体，让 细胞适应固态的电子受体，再将其转入富马酸钠 0.1 作最终电子受体培养基中，最后转接入微生物电 池中.电池环境中惟一的电子受体就是石墨电 2000 4000 60008000 时间min 极.细胞代谢醋酸盐的过程中，细胞膜外累积的 还原型细胞色素失去电子给阳极石墨棒，电子再 图6微生物电池运转30d后，在箭头处替换阳极溶液新的含 醋酸盐的培养基但保留阳极石墨棒。 通过外电阻达到阴极石墨棒，在阴极的溶解氧最 Fig.6 After the microbial fuel cell had been working for 30d 终得到电子，被还原生成水，整个电池反应过程 at the indicated times represented by the arrows medium in the 如下. anodic chamber was removed and replaced with sterile anaero- 阳极： bic medium plus I mL of 10 mmdl'L acetate
图 3 AQDS 对 Geobacter metallired ucens 异化还原 Fe(OH)3 (100 mmol·L -1)速率的影响 Fig.3 Effect of AQDS on the dissimilatory reduction of Fe (OH)3(100 mmol·L -1) 图 4 AQDS 对 Geobacter metallired ucens 异化还原 Fe(OH)3 (100 mmol·L-1)速率的影响(长时间内) Fig.4 Effect of AQDS on the dissimilatory reduction of Fe (OH)3(100 mmol·L -1)in a long term 2.3 微生物直接吸附传递电子予固体电子受体 为了消除干扰因素, 更直接、准确地研究 Geobacter metallireducens 利用直接吸附进行胞 外电子传递从而异化还原电子受体的方式 ,利用 微生物燃料电池体系,以阳极石墨棒替代 Fe(OH)3 固体颗粒作电子受体来研究这一直接吸附接触异 化还原方式 .先用 Fe(OH)3 作最终电子受体 ,让 细胞适应固态的电子受体 ,再将其转入富马酸钠 作最终电子受体培养基中 ,最后转接入微生物电 池中.电池环境中惟一的电子受体就是石墨电 极.细胞代谢醋酸盐的过程中, 细胞膜外累积的 还原型细胞色素失去电子给阳极石墨棒 ,电子再 通过外电阻达到阴极石墨棒, 在阴极的溶解氧最 终得到电子, 被还原生成水 .整个电池反应过程 如下 . 阳极 : CH3COO -+2H2O Geobacter .metallireducens 2CO2 +7H ++8e - . 阴极 :O2 +4e - +4H + 2H2O . 其中 ,阳极室产生的 H +通过质子交换膜可以达 到阴极室 ,与还原的氧反应生成水 . 该电池体系中 ,外电阻通过的电流直接反应 了异化还原的速率 , 也即细胞失去电子给予固态 电子受体的速率. 由图 5 可知 , 从零时刻接种到电流达到一个 稳定的平台,需要一个较长的时间 . 图5 微生物燃料电池零时刻接种细胞(10%)后电流的变化 (a)AQDS 50μmol (b)无 AQDS Fig.5 Electron transfer in a microbial fuel cell by Geobacter metallireducens .In the mi crobial fuel cell , graphite electrode was served as sole el ectron acceptor , acetate as electron donor, 10%inoculum :(a)50μmol AQDS;(b)without AQDS 如图 6 所示,若电池长时间反应后 ,用新的含 醋酸盐的培养基替换阳极溶液 ,保留原来的电极, 不仅不需要再接种细胞 ,而且可以迅速达到原来 的电子传递速率. 图 6 微生物电池运转 30 d 后, 在箭头处替换阳极溶液新的含 醋酸盐的培养基, 但保留阳极石墨棒. Fig.6 After the mi crobial fuel cell had been working for 30 d, at the indicated times represented by the arrows, medium in the anodic chamber was removed and replaced with sterile, anaerobic medium plus 1 mL of 10 mmol·L -1 acetate Vol.28 No.6 冯雅丽等:Geobacter metallireducens 异化还原铁氧化物三种方式 · 527 ·
。528· 北京科技大学学报 2006年第6期 图5和图6表明，Geobacter metallireducens Fe(OH)3颗粒表面，成熟的生物膜形成了，直接吸 在利用石墨电极作最终的电子受体时，真正起主 附接触的电子传递是主导的传递方式，AQDS的 导作用的是长时间反应后逐渐生长、吸附在电极 作用因扩散阻力增大而不再明显. 上的细胞，这些细胞通过自身的分泌物相互连接 AQDS 形成致密的生物膜，如图7.生物膜的形成需要 0.4 经历如下过程：可逆吸附一不可逆吸附一多个微 0.3 生物菌落的形成和逐渐扩大一成熟的生物膜一生 物膜的老化解离. 0.2 1000 2000 3000 时间min 图8电池运转稳定，生物膜成熟后加入AQDS对电流的影响 Fig.8 Effect of AQDS on the current produced by Geobacter metallireducens after the biofilm became mature 3异化还原铁氧化物三种方式的应 图7电池运转30d后阳极石墨棒上吸附的细胞（生物膜）电 用展望 镜图（截面图） 微生物异化还原金属氧化物的过程是自然界 Fig.7 SEM image of an anodic electrode surface covered by 中广泛存在一个重要生命过程，在生物冶金、环境 Geobacter metallireduans.Electrode had been immerged in the 治理领域具有很大的潜在应用价值.针对微生物 anode chamber of a microbial fuel cell for 30 d. 采取三种方式对金属氧化物进行异化还原，不同 结合前文直接还原Fe(OH)3反应需要长时 微生物在不同环境下会采取不同的策略选择及组 间才能达到一个稳定的较高值，由此提出： 合.在实际的工程应用中，同样需要采取不同的 Geobacter metallireducens通过直接吸附接触方 加速异化还原速率的策略组合，例如，生物浸出 式异化还原固态电子受体时，需要一个较长时间 治金中，综合环境因素考虑是否可加入合适的络 慢慢在固态电子受体表面形成成熟生物膜. 和剂、电子传递中间体：考虑到异化还原速率与生 Gebacter metallireducens还原Fe(OH23,开始时 物膜接触固体氧化矿的面积有关需要加大固体 速度很慢，是因为微生物还处在慢慢生长、吸附的 氧化矿表面的生物可及性：而考虑到生物膜的形 过程中，一旦生物膜成熟，细胞完全吸附覆盖了 成需要一个较长的时间，接种及反应器设计上应 Fe(OH)3颗粒的表面，还原速度会达到一个稳定 考虑如何缩短生物膜的形成时间. 的较高值，并且会维持一段很长的时间 4 如图5的(a),(b)曲线的对比可知，在微生 结论 物电池开始接种时加入AQDS,AQDS的加速异 (1)NTA等络和剂可以在初始阶段显著加 化还原的效果很明显，稳定的电流平台要比未加 速Geobacter metallireducens还原Fe(OH)3. 入AQDS的高，而且生物膜成熟的也快这与 (2)AQDS等电子传递中间体可在初始阶段 Fe(OH)3还原体系中，初期加入AQDS,短时间内 显著加速Geobacter metallireducens还原Fe(OH)3. 的F+浓度的变化（如图3）是相互应证的.当微 (3)二次成矿生成的磁铁矿能阻碍Gebac- 生物电池运转稳定，生物膜成熟以后加入AQDS, ter metallireducens还原Fe(OH)3,而NTA, 如图8所示，只能略微地提高电流.实验过程中 AQDS加速Fe+生成的同时，也加速了磁铁矿生 AQDS参与电极反应，细胞失去电子给AQDS,使 成.两者均不能消除这种阻碍. 其还原成AHQDS(棕红色)：AHQDS再失去电子 (4)Geobacter metal lireducens在还原固态电 给电极，自身被氧化为AQDS.由此可推测 子受体的三种方式中，直接接触方式起着重要作 Fe(OH)3中，如果细胞已经完全吸附覆盖了 用，其中吸附形成的生物膜是一个关键因素，而生
图 5 和图 6 表明 , Geobacter metallireducens 在利用石墨电极作最终的电子受体时 , 真正起主 导作用的是长时间反应后逐渐生长、吸附在电极 上的细胞 ,这些细胞通过自身的分泌物相互连接, 形成致密的生物膜, 如图 7 .生物膜的形成需要 经历如下过程 :可逆吸附 —不可逆吸附 —多个微 生物菌落的形成和逐渐扩大—成熟的生物膜 —生 物膜的老化解离 . 图 7 电池运转 30 d 后阳极石墨棒上吸附的细胞(生物膜)电 镜图(截面图) Fig.7 SEM image of an anodic el ectrode surface covered by Geobacter metallireducens .Electrode had been immerged in the anode chamber of a microbial fuel cell for 30 d. 结合前文直接还原 Fe(OH)3 反应需要长时 间才 能达 到一 个稳定 的较 高值 , 由 此提 出: Geobacter metallireducens 通过直接吸附接触方 式异化还原固态电子受体时, 需要一个较长时间 慢慢在固态电 子受体表面形成成 熟生物膜. Geobacter metallireducens 还原 Fe(OH)3 , 开始时 速度很慢 ,是因为微生物还处在慢慢生长、吸附的 过程中 , 一旦生物膜成熟 , 细胞完全吸附覆盖了 Fe(OH)3 颗粒的表面, 还原速度会达到一个稳定 的较高值 ,并且会维持一段很长的时间 . 如图 5 的(a), (b)曲线的对比可知, 在微生 物电池开始接种时加入 AQDS ,AQDS 的加速异 化还原的效果很明显 , 稳定的电流平台要比未加 入 AQDS 的高, 而且生物膜成熟的也快, 这与 Fe(OH)3还原体系中 , 初期加入 AQDS , 短时间内 的 Fe 2 +浓度的变化(如图 3)是相互应证的 .当微 生物电池运转稳定, 生物膜成熟以后加入 AQDS , 如图 8所示, 只能略微地提高电流.实验过程中 AQDS 参与电极反应 ,细胞失去电子给 AQDS ,使 其还原成 AHQDS(棕红色);AHQDS 再失去电子 给电极 , 自 身被 氧化为 AQDS .由 此可 推测 Fe(OH)3中 , 如 果细 胞已 经完 全吸 附覆 盖了 Fe(OH)3颗粒表面 ,成熟的生物膜形成了, 直接吸 附接触的电子传递是主导的传递方式, AQDS 的 作用因扩散阻力增大而不再明显. 图 8 电池运转稳定, 生物膜成熟后加入 AQDS 对电流的影响 Fig.8 Effect of AQDS on the current produced by Geobacter metallireducens after the biofilm became mature 3 异化还原铁氧化物三种方式的应 用展望 微生物异化还原金属氧化物的过程是自然界 中广泛存在一个重要生命过程 ,在生物冶金 、环境 治理领域具有很大的潜在应用价值 .针对微生物 采取三种方式对金属氧化物进行异化还原 ,不同 微生物在不同环境下会采取不同的策略选择及组 合.在实际的工程应用中, 同样需要采取不同的 加速异化还原速率的策略组合.例如 , 生物浸出 冶金中 ,综合环境因素考虑是否可加入合适的络 和剂 、电子传递中间体;考虑到异化还原速率与生 物膜接触固体氧化矿的面积有关, 需要加大固体 氧化矿表面的生物可及性 ;而考虑到生物膜的形 成需要一个较长的时间 ,接种及反应器设计上应 考虑如何缩短生物膜的形成时间. 4 结论 (1)NTA 等络和剂可以在初始阶段显著加 速 Geobacter metallireducens 还原 Fe(OH)3 . (2)AQDS 等电子传递中间体可在初始阶段 显著加速 Geobacter metallireducens 还原Fe(OH)3 . (3)二次成矿生成的磁铁矿能阻碍 Geobacter metallireducens 还 原 Fe (OH)3 , 而 NTA , AQDS 加速 Fe 2 +生成的同时, 也加速了磁铁矿生 成.两者均不能消除这种阻碍. (4)Geobacter metallireducens 在还原固态电 子受体的三种方式中 , 直接接触方式起着重要作 用,其中吸附形成的生物膜是一个关键因素 ,而生 · 528 · 北 京 科 技 大 学 学 报 2006 年第 6 期