华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 004-7 主讲教师:柳俊博士、教授 玉米:幼胚 340 78 杜娟等,2002 100 Mol 17 4112 8902 846 38 477 100 47 吉853 吉921 32 44 0.4 2.外植体的类型 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲,生 理状态年轻,来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养,但具 体到不同的植物类型则有较大差异。 外植体选取合理与否,不仅影响培养的难易,而且有时甚至影响分化的程度和器 官类型。1974年 Tran ThanhⅤan等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养,结果不 同部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。 四、激素对器官分化的调控 激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化,在大 多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中,生长素与 细胞分裂素是两类主要的植物激素,在离体器官分化调控中占有主导地位, 离体培养中,外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果 表22外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量* 培养时间 外源生长素浓度( ng/g FW) 生长素 游离形式 总浓度 2,4-D23,2474+3,9127 21,9794±2,526.3 NAA 993±97 1776.7±50.1 [H4]AA30.3±3.5 7,5570±279.0 2,4-D 20.003.8±4.365.9 33,1194±3,835.0 NAA 64.8±17.5 1.637.0±509.8 [H4JIAA3.4+1.4 763.5±420.0 *引自 Ribnicky等,19
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 玉米：幼胚 340 7922 Mol 17 4112 8902 846 477 吉 853 吉 921 444 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 78 86 62 53 57 38 47 11 32 0.4 杜娟等，2002 2．外植体的类型 外植体对诱导反应及其再生能力的影响体现在外植体的生理状态上。总体来讲，生 理状态年轻，来源于生长活跃或生长潜力大的组织和器官的细胞更有利于培养，但具 体到不同的植物类型则有较大差异。 外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器 官类型。1974 年 Tran Thanh Van 等取烟草正在开花的植株的薄层表皮进行培养，结果不 同部位的表皮外植体所形成的芽的类型不同。 四、激素对器官分化的调控 激素在细胞生长与个体发育中具有重要的调控作用。离体培养下的器官分化，在大 多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与 细胞分裂素是两类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。 离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。 表 2.2 外源生长素在胡萝卜上胚轴培养细胞中的总量和游离生长素含量* 培养时间 外源生长素浓度（ng/g FW） 生长素 游离形式 总浓度 1 周 2，4－D 23,247.4±3,912.7 21,979.4±2,526.3 NAA 99.3±9.7 1,776.7±50.1 [ 2H4]IAA 30.3±3.5 7,557.0±279.0 4 周 2，4－D 20,003.8±4,365.9 33,119.4±3,835.0 NAA 64.8±17.5 1,637.0±509.8 [ 2H4]IAA 3.4±1.4 763.5±420.0 * 引自 Ribnicky 等，1996。 16
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 五、光照对器官分化的影响 光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响 由于培养条件下光合作用能力较低,因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分 化状态,而不是合成光合产物。 光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关, 六.器官分化的基因调控 同源框( homebox)基因 KnI (Knotted STM(Shootmeristemless) cdc2 ESRI bZIP(PKSFⅠ) SRD、SRD2和SRD3 第三节体细胞胚胎发生 离体培养下没有经过受精过程,但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物(不 管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞),统称为体细胞胚或胚状体 这一定义有以下几方面的界定 其一,体细胞胚是离体培养的产物,只限于在离体培养范围使用,以区别于无融 合生殖胚 其二,体细胞胚起源于非合子细胞,以区别于合子胚; 其三,体细胞经过了胚胎发育过程,以区别与离体培中器官发生形成个体的途径 (崔凯荣和戴若兰,2000 、体细胞胚的形成 1.体细胞胚从外植体上直接发生 在以叶片为外植体的培养中,体细胞胚的直接形成可分为两个阶段: 第一个阶段为诱导期。在此阶段中,叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激,进 入分裂状态。 第二个阶段是胚胎发育期。在这一阶段,形成的瘤状物继续发育,经过球形胚、心形胚 等发育过程,最后形成体细胞胚
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 五、光照对器官分化的影响 光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。 由于培养条件下光合作用能力较低，因此光照的作用更大程度上是调节细胞的分 化状态，而不是合成光合产物。 光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。 六．器官分化的基因调控 同源框（homebox）基因： Kn1（KNOTTED1） STM（Shootmeristemless） cdc2 ESR1 bZIP（PKSF1） SRD1、SRD2 和 SRD3 第三节 体细胞胚胎发生 离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不 管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。 这一定义有以下几方面的界定： 其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融 合生殖胚； 其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； 其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径 （崔凯荣和戴若兰，2000）。 一、体细胞胚的形成 1．体细胞胚从外植体上直接发生 在以叶片为外植体的培养中，体细胞胚的直接形成可分为两个阶段： 第一个阶段为诱导期。在此阶段中，叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受培养刺激，进 入分裂状态。 第二个阶段是胚胎发育期。在这一阶段，形成的瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚 等发育过程，最后形成体细胞胚。 17
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 2.经过愈伤组织的体细胞胚发生 经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段 第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织; 第二阶段是诱导愈伤组织胚性化 第三阶段是体细胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子叶为外植体时,通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生,进而发 生体细胞胚。因此,经过愈伤组织的体细胞胚胎发生,胚性愈伤组织的形成是培养的关 键 进而发生原胚,经过不同时期完成体细胞胚胎发育(图1.12)。 图1.12蝴蝶兰茎段外植体经过愈伤组织的体细胞胚发生(引自Lin等,2000)0 3.细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中,体细胞胚胎形成的细胞学观察表明,其培养物中存在 两种类型的细胞:一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞,这类细胞一般 不具备胚胎发生潜力;二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞,这类细胞具有成 胚能力,因而,把这类细胞团又称为胚性细胞团。 胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后,其外围的许多细胞开始第一次 不均等分裂,靠近细胞团方向的一个细胞较大,以后发育成类似胚柄的结构。另一个细 胞则继续分裂形成类似原胚的结构,以后经过类似于体内的发育过程,经球形期、心形 期等发育阶段形成完整的体细胞胚(李浚明,1991) 通过悬浮细胞系再生体细胞胚,由于胚性细胞可以继代增殖,因此可以提高胚胎 的生产效率。 体细胞胚的结构与发育特点 与器官发生形成个体的途径相比 体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。一是体细胞胚具有双极性( double polarity),二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少,即出现所谓的生理隔 离( physiological isolation)现象。 由于大多数体细胞胚起源于单细胞,因此对于单个植株来讲,通过体细胞胚形成 的再生植株,其遗传特性相对稳定。 与合子胚相比 合子胚在发育初期具有明显的胚柄,而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚 柄的结构。特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚,这一点更为明显
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 2．经过愈伤组织的体细胞胚发生 经过愈伤组织的胚胎发生需要三个培养阶段： 第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织； 第二阶段是诱导愈伤组织胚性化； 第三阶段是体细胞胚形成。 在以幼胚、胚以及子叶为外植体时，通常可以直接诱导胚性愈伤组织产生，进而发 生体细胞胚。因此，经过愈伤组织的体细胞胚胎发生，胚性愈伤组织的形成是培养的关 键。 进而发生原胚，经过不同时期完成体细胞胚胎发育（图 1.12）。 图 1.12 蝴蝶兰茎段外植体经过愈伤组织的体细胞胚发生（引自 Lin 等，2000） 3．细胞悬浮培养的体细胞胚胎发生 在胡萝卜细胞悬浮培养中，体细胞胚胎形成的细胞学观察表明，其培养物中存在 两种类型的细胞：一是自由分散在培养基中的大而高度液泡化的细胞，这类细胞一般 不具备胚胎发生潜力；二是成簇成团的体积小而细胞质致密的细胞，这类细胞具有成 胚能力，因而，把这类细胞团又称为胚性细胞团。 胚性细胞团转移到适宜的胚胎发生培养基上以后，其外围的许多细胞开始第一次 不均等分裂，靠近细胞团方向的一个细胞较大，以后发育成类似胚柄的结构。另一个细 胞则继续分裂形成类似原胚的结构，以后经过类似于体内的发育过程，经球形期、心形 期等发育阶段形成完整的体细胞胚（李浚明，1991）。 通过悬浮细胞系再生体细胞胚，由于胚性细胞可以继代增殖，因此可以提高胚胎 的生产效率。 二、体细胞胚的结构与发育特点 与器官发生形成个体的途径相比： 体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点。一是体细胞胚具有双极性（double polarity），二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔 离（physiological isolation）现象。 由于大多数体细胞胚起源于单细胞，因此对于单个植株来讲，通过体细胞胚形成 的再生植株，其遗传特性相对稳定。 与合子胚相比： 合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚 柄的结构。特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚，这一点更为明显。 18
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 合子胚的子叶是相当规范的,可以作为分类的依据,而体细胞胚的子叶常不规范, 有时具有两片以上的子叶。 与相同植物比较,体细胞胚的体积明显小于合子胚。 体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期 以后,经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。 三、影响体细胞胚发生的因素 1.外源激素对体细胞胚胎发生的调控 2,4一D是应用最为广泛的生长素。 2,4-D的应用有着规律性的变化。首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成,然 后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎,一般在球形胚形成后,除去生长素则有利 于体细胞胚的继续发育。 2.培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响 体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。 球形胚形成后,如果降低培养基的无机盐浓度,可以显著促进体细胞胚的进一步 发育。 在一些试验中还发现,体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度,也有利于胚的继续发育 和提高体细胞胚的成苗率 3.不同基因型间体细胞胚形成能力的差异 体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异 在已成功获得体细胞胚的植物中,以自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多 且培养条件相对较为简单,如咖啡属植物、芸香科植物等 即使是同类植物的不同基因型,在体细胞胚诱导的难易、形成时间以及单个外植体 产生体细胞胚的数量上也存在明显差异。马铃薯18个不同基因型品种的体细胞胚形成能 力的比较研究显示,以接种外植体与体细胞胚能否形成的资料统计,有7个品种的体细 胞胚发生率为100%,而频率最低则只有10%。 四、体细胞胚胎发生的生化与分子基础 1.体细胞胚形成过程中内源生长素的变化 体细胞胚胎发育硏究表明,外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内 源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。 体细胞胚胎发生中,外源生长素的使用模式或者说规律,在大多数植物中是相似的 如诱导胚性细胞产生,或诱导愈伤组织转化为胚性愈伤组织,均需要高浓度的生长素
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，而体细胞胚的子叶常不规范， 有时具有两片以上的子叶。 与相同植物比较，体细胞胚的体积明显小于合子胚。 体细胞胚没有休眠而体细胞胚则直接形成植株。合子胚在胚胎发育完全进入子叶期 以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠。 三、影响体细胞胚发生的因素 1．外源激素对体细胞胚胎发生的调控 2，4－D 是应用最为广泛的生长素。 2，4－D 的应用有着规律性的变化。首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然 后在降低 2，4－D 的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素则有利 于体细胞胚的继续发育。 2．培养基及培养条件对体细胞胚形成的影响 体细胞胚的产生要求培养基中含有一定浓度的还原态氮。 球形胚形成后，如果降低培养基的无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步 发育。 在一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育 和提高体细胞胚的成苗率。 3．不同基因型间体细胞胚形成能力的差异 体细胞胚的产生在不同类型的植物间具有明显差异。 在已成功获得体细胞胚的植物中，以自然条件下容易产生无融合生殖胚的植物为多， 且培养条件相对较为简单，如咖啡属植物、芸香科植物等。 即使是同类植物的不同基因型，在体细胞胚诱导的难易、形成时间以及单个外植体 产生体细胞胚的数量上也存在明显差异。马铃薯 18 个不同基因型品种的体细胞胚形成能 力的比较研究显示，以接种外植体与体细胞胚能否形成的资料统计，有 7 个品种的体细 胞胚发生率为 100％，而频率最低则只有 10％。 四、体细胞胚胎发生的生化与分子基础 1．体细胞胚形成过程中内源生长素的变化 体细胞胚胎发育研究表明，外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内 源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的。 体细胞胚胎发生中，外源生长素的使用模式或者说规律，在大多数植物中是相似的， 如诱导胚性细胞产生，或诱导愈伤组织转化为胚性愈伤组织，均需要高浓度的生长素。 19
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 当球形胚形成后,则需要降低生长素水平才能完成体细胞胚的继续发育。 研究显示,生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的。 2.体细胞胚发生过程中的特异蛋白质 有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化,尽管不同研究在绝对含量上不尽相 ,但总体趋势均表现出,体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加 表24水稻不同愈伤组织(干重)可溶性蛋白质含量(μgmg) 可溶性蛋白质胚性愈伤组织非胚性愈伤组织 继代10次的愈伤组 水溶性蛋白质1363 94.5 115.3 盐溶性蛋白质300 17.6 醇溶性蛋白质106 144 10.9 碱溶性蛋白质13.2 144 13.6 *引自李中奎等,1993。 阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs) 某些病程相关蛋白可能也与体细胞胚的形成有关。 3.体细胞胚形成的基因表达调控 通过基因表达的差异显示和胚胎发育突变体等技术,已分离出几十个与体细胞胚发 育相关的基因。除了一些典型的激素调控基因外,还有其它类型的基因。 表25胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因 基因表达产物表达时期资料来源 DC8LEA(Grp3)心形胚 Borrkird等,1986; franz等, 1989: Halzopoulos 1990 DC59 Oleosin 心形胚 Choi等,1987; Hatzopoulos等, DC3LEA(Grp3)原胚、球形胚、心Wlde等,1988 形胚 EMB-lLEA(Grp1)球形胚、心形胚 Ulrich等,1990; Wurtele等, 1993 ECP3lLEA(Grp4)原胚 Kiyosue等,1992,1993 ECP40LEA(Grp2)原胚
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 当球形胚形成后，则需要降低生长素水平才能完成体细胞胚的继续发育。 研究显示，生长素的这一应用规律与胚胎发育过程中内源激素的变化是一致的。 2．体细胞胚发生过程中的特异蛋白质 有关体细胞胚形成中蛋白质含量和组分的变化，尽管不同研究在绝对含量上不尽相 同，但总体趋势均表现出，体细胞胚形成过程中水溶性蛋白明显增加。 表 2.4 水稻不同愈伤组织（干重）可溶性蛋白质含量（μgmg -1）* 可溶性蛋白质 胚性愈伤组织 非胚性愈伤组织 继代 10 次的愈伤组 织 水溶性蛋白质 盐溶性蛋白质 醇溶性蛋白质 碱溶性蛋白质 136.3 30.0 10.6 13.2 94.5 17.6 14.4 14.4 115.3 24.5 10.9 13.6 *引自李中奎等，1993。 阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs） 某些病程相关蛋白可能也与体细胞胚的形成有关。 3．体细胞胚形成的基因表达调控 通过基因表达的差异显示和胚胎发育突变体等技术，已分离出几十个与体细胞胚发 育相关的基因。除了一些典型的激素调控基因外，还有其它类型的基因。 表 2.5 胡萝卜体细胞胚形成相关的部分基因 基 因 表达产物 表 达 时 期 资 料 来 源 DC8 LEA（Grp3） 心形胚 Borrkird 等，1986；Franz 等， 1989；Halzopoulos 等，1990 DC59 Oleosin 心形胚 Choi 等，1987；Hatzopoulos 等， 1990 DC3 LEA（Grp3） 原胚、球形胚、心 形胚 Wilde 等，1988 EMB-1 LEA（Grp1） 球形胚、心形胚 Ulrich 等，1990；Wurtele 等， 1993 ECP31 LEA（Grp4） 原胚 ECP40 LEA（Grp2） 原胚 Kiyosue 等，1992，1993 20