减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因 UB/1编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52)对数生长期表达稳定期关闭 UB/2编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52)对数生长期表达稳定期关闭 UB/3编码泛素-羧基延伸蛋白76(CEP76)对数生长期表达稳定期关闭 UB4编码泛素五聚体 对数生长期关闭稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因: UBC1、UBc2、UBC3、UBC4、UBC5、UBc6、UBC7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因 酵母菌共有四个泛素编码基因： 酵母菌共有四个泛素编码基因： UBI UBI 11 编码编码泛素泛素--羧基延伸蛋白 羧基延伸蛋白5252（（CEP52 CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 ） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI UBI 22 编码编码泛素泛素--羧基延伸蛋白 羧基延伸蛋白5252（（CEP52 CEP52） 对数生长期表达 稳定期关闭 ） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI UBI 33 编码编码泛素泛素--羧基延伸蛋白 羧基延伸蛋白7676（（CEP76 CEP76） 对数生长期表达 稳定期关闭 ） 对数生长期表达 稳定期关闭 UBI UBI 44 编码编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达 泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： 酵母菌共有七个泛素连接酶基因： UBC UBC 11、、UBC UBC 22、、UBC UBC 33、、UBC UBC 44、、UBC UBC 55、、UBC UBC 66、、UBC UBC 77
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UB/4缺陷型: 在酿酒酵母菌中,泛素主要由UB/4基因表达,UB/4突变株能 正常生长,但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多, 因此UB/4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA1缺陷型: UBA1编码泛素激活酶E1,UBA1突变株是致死性的,但其等位 基因缺陷是非致死性的,而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4-ubc5双突变型 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4--突变株能 突变株能 UBI UBI 44缺陷型： 缺陷型： 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多， 因此因此UBI UBI 44缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 缺陷突变株是外源基因表达理想的受体 UBA UBA 11缺陷型： 缺陷型： UBA UBA 11编码编码泛素激活酶 泛素激活酶E1E1，，UBA UBA 11突变株是致死性的，但其等位 突变株是致死性的，但其等位 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解 Ubc4 - ubc5 Ubc4 - ubc5 双突变型： 双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
7外源基因在酵母菌中的表达 C酵母菌的载体系统 酵母菌中的野生型质粒 ●酵母菌克隆表达质粒的构建
C 酵母菌的载体系统 酵母菌的载体系统 7 外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达 酵母菌克隆表达质粒的构建 酵母菌克隆表达质粒的构建 酵母菌中的野生型质粒 酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒 酿酒酵母中的2μ环状质粒 REP1 FLP 几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双链 环状质粒,拷贝数达50至100个。 RAF Rs反向重复序列,600bp,重组 n R FLP编码产物驱动Rs的同源重组 STB 尺E尸编码产物控制质粒的稳定性 REP2 同源重组 STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSR1和pSB1,以及 克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质 B 粒类似
酵母菌中的野生型质粒 酵母菌中的野生型质粒 酿酒酵母中的 2 µ环状质粒 几乎所有的酿酒酵母中都含有 几乎所有的酿酒酵母中都含有22 µµ双链双链 同源重组 同源重组 REP1 REP1 RAF RAF STB STB ori ori REP2 REP2 FLP FLP IRIR IRIR AA BB 环状质粒，拷贝数达 环状质粒，拷贝数达5050 至至100 100个。个。 IRs IRs 反向重复序列， 反向重复序列，600 bp 600 bp，重组 ，重组 FLP FLP 编码产物驱动 编码产物驱动IRs IRs的同源重组 的同源重组 REP REP 编码产物控制质粒的稳定性 编码产物控制质粒的稳定性 STB STB REP REP的结合位点 的结合位点 接合酵母属中的 接合酵母属中的pSR1 pSR1 和和pSB1 pSB1，以及 ，以及 克鲁维酵母属中的 克鲁维酵母属中的pKD1 pKD1等均与 等均与 22 µµ质质 粒类似。 粒类似