细胞生物学教程 http://www.cella.cn (六)、偏光显微镜 偏光显微镜( polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、 纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器), 使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的 起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无 论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折 射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种 物体。 (七)、微分干涉差显微镜 1952年, Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜 ( differential interference contrast microscope)。D|C显微镜又称 Nomarski相差 显微镜( Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。 DC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。D|C利 用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器( polarizer)、DC棱镜、DC滑行 器和检偏器( analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。 在聚光器中则安装了石英 Wollaston棱镜,即DC棱镜,此棱镜可将一束光分解成 偏振方向不同的两束光(ⅹ和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微 镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的 厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个 Wollaston棱镜,即DC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面 (ⅹ和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜 DC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具 有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多 少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达 到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到 最佳状态,可通过调节DC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的 亮度。调节DC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧 亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图 2-10)
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 19 （六）、偏光显微镜 偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、 纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器）， 使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的 起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无 论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折 射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种 物体。 （七）、微分干涉差显微镜 1952 年，Nomarski 在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜 （differential interference contrast microscope）。DIC 显微镜又称 Nomarski 相差 显微镜（Nomarki contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。 与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC 显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC 利 用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC 棱镜、DIC 滑行 器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。 在聚光器中则安装了石英 Wollaston 棱镜，即 DIC 棱镜，此棱镜可将一束光分解成 偏振方向不同的两束光（x 和 y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微 镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的 厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个 Wollaston 棱镜，即 DIC 滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面 （x 和 y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜 DIC 影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具 有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x 和 y 波的光程差决定着透光的多 少。光程差值为 0 时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达 到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到 最佳状态，可通过调节 DIC 滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的 亮度。调节 DIC 滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧 亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕（图 2-10）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-10DC显微镜下的硅藻(伪彩色) DC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体 感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在 这种显微镜下进行 (八)、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后 者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。 图2-11莱卡倒置显微镜
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 20 图 2-10 DIC 显微镜下的硅藻（伪彩色） DIC 显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体 感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在 这种显微镜下进行。 （八）、倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后 者在载物台之上（图 2-11），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 图 2-11 莱卡倒置显微镜
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发 展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合 方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DC、摄影装置于一体,从而操作灵活, 使用方便。 电子显微镜 (一)、透射电子显微镜 1、基本原理 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构,这些结构称为亚显微结构 ( submicroscopic structures)或超微结构( ultramicroscopic structures ultrastructures)。要想看清这些结构,就必须选择波长更短的光源,以提高显微镜 的分辨率。1932年 Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜( transmission electron microscope,TEM),电子束的波长要比可见光和紫外光短得多,并且电 子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比,也就是说电压越高波长越短。目前 TEM的分辨力可达02nm 电子显微镜(图2-12)与光学显微镜的成像原理基本一样,所不同的是前者用 电子束作光源,用电磁场作透镜。另外,由于电子束的穿透力很弱,因此用于电镜 的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机 ( ultramicrotome)制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明 系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 表22不同光源的波长 名称可见光|紫外光X射线a射线 电子束 10Ky 波长(m)390-76013-390005-130005-1012300122 2、制样技术 1)超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品,以环氧树脂包埋,以热膨胀或螺旋推进的方式 推进样品切片(图2-13),切片厚度20~50nm,切片采用重金属盐染色,以增大反 差(图2-14)
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 21 进入 20 世纪 80 年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发 展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合 方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活， 使用方便。 二、电子显微镜 （一）、透射电子显微镜 1、基本原理 在光学显微镜下无法看清小于 0.2µm 的细微结构，这些结构称为亚显微结构 （ submicroscopic structures ）或超微结构（ ultramicroscopic structures ； ultrastructures）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜 的分辨率。1932 年 Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电 子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前 TEM 的分辨力可达 0.2nm。 电子显微镜（图 2-12）与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用 电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜 的标本须制成厚度约 50nm 左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机 （ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明 系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等 5 部分构成。 表 2-2 不同光源的波长 电子束 名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线 0.1Kv 10Kv 波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122 2、制样技术 1）超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式 推进样品切片（图 2-13），切片厚度 20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反 差（图 2-14）
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-12JEM-1011透射电子显微镜 EICA UD 图2-13莱卡超薄切片机
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 22 图 2-12 JEM-1011 透射电子显微镜 图 2-13 莱卡超薄切片机
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-14内质网透射电镜图(伪彩色) )负染技术 负染就是用重金属盐(如磷钨酸、醋酸双氧铀)对铺展在载网上的样品进行染 色;吸去染料,样品干燥后,样品凹陷处铺了一薄层重金属盐,而凸的出地方则没 有染料沉积,从而出现负染效果(图2-15),分辨力可达1.5nm左右。 给 Pointed Barbed end 图2-15肌动蛋白纤维的负染电镜照片
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 23 图 2-14 内质网透射电镜图（伪彩色） 2）负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染 色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没 有染料沉积，从而出现负染效果（图 2-15），分辨力可达 1.5nm 左右。 图 2-15 肌动蛋白纤维的负染电镜照片