细胞生物学教程 http://www.cella.cn 3)冰冻蚀刻 冰冻蚀刻( freeze- etching)亦称冰冻断裂( freeze- fracture)。标本置于-100c 的干冰或-196°C的液氮中,进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开,升温后,冰在 真空条件下迅即升华,暴露出断面结构,称为蚀刻( etching)。蚀刻后,向断面以 45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角喷涂一层碳,加强反差和强度。然后用次氯 酸钠溶液消化样品,把碳和铂的膜剥下来,此膜即为复膜( replica)。复膜显示出了 标本蚀刻面的形态,在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构(图 2-16) chondron 图2-16冰冻蚀刻电镜照片 (二)、扫描电子显微镜 扫描电子显微镜( scanning electron microscope,SEM,图2-17、18、19) 于20世纪60年代问世,用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电 子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子的多少与电子束入射角有关 也就是说与样品的表面结构有关,次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变 为光信号,再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度, 显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象,反映了标本的表面结构。为了 使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重 金属在电子束的轰击下发出次级电子信号
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 24 3）冰冻蚀刻 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100˚C 的干冰或-196˚C 的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在 真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以 45 度角喷涂一层蒸汽铂，再以 90 度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯 酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了 标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构（图 2-16）。 图 2-16 冰冻蚀刻电镜照片 （二）、扫描电子显微镜 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，图 2-17、18、19） 于 20 世纪 60 年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电 子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关， 也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变 为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度， 显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了 使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重 金属在电子束的轰击下发出次级电子信号
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 目前扫描电镜的分辨力为6-10nm,人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的 光点,则扫描电镜的最大有效放大倍率为0.2mm/10n=20000X 图2-17JEOL扫描电子显微镜 eyepiece projector VIEWING MAGE VIEWED MAGE ON ORESCENT SCREEN LIGHT SCANNING MICROSCOP ELECTRON MICROSCOPE ELECTRON MICROSCOPE 图2-18光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 25 目前扫描电镜的分辨力为 6~10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距 0.2mm 的 光点，则扫描电镜的最大有效放大倍率为 0.2mm/10nm=20000X。 图 2-17 JEOL 扫描电子显微镜 图 2-18 光学显微镜、TEM、SEM 成像原理比较
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 图2-19人类血细胞SEM照片 图片来自htp/ww.denniskunkel.com (三)、扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜( scanning tunneling microscope,STM)由 Binnig等1981 年发明,根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳 米的高度上扫描样品时,此处电子云重叠,外加一电压(2mV2V),针尖与样品之 间产生隧道效应而有电子逸出,形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有 函数关系,当探针沿物质表面按给定高度扫描时,因样品表面原子凹凸不平,使探 针与物质表面间的距离不断发生改变,从而引起电流不断发生改变。将电流的这种 改变图像化即可显示岀原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高,横向 为01-02nm,纵向可达0.001nm。它的优点是三态(固态、液态和气态)物质均 可进行观察,而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子,如DNA、RNA和蛋白质等分子的 原子布阵,和某些生物结构,如生物膜、细胞壁等的原子排列 三、显微操作技术 显微操作技术( micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下,利 用显微操作器( micromanipulator,图2-20)进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切 割等。细胞核移植技术已有几十年的历史, Gordon等人(1962)对非洲爪蟾进行 核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 26 图 2-19 人类血细胞 SEM 照片 图片来自 http://www.denniskunkel.com/ （三）、扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由 Binnig 等 1981 年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳 米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之 间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有 函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探 针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种 改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向 为 0.1~0.2nm，纵向可达 0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均 可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如 DNA、RNA 和蛋白质等分子的 原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。 三、显微操作技术 显微操作技术（micromanipulation technique）是指在高倍复式显微镜下，利 用显微操作器（micromanipulator，图 2-20）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切 割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon 等人（1962）对非洲爪蟾进行 核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 并取得了丰硕成果 图2-20尼康NT-88NE显微操作/注射仪(图片来自htt/ w.nikon. com) 第二节生物化学与分子生物学技术 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的, 没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。 细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色( histochemical or cytochemical staining)是利用染 色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理,对某种成分进行定性或定位研究 的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示,包括有无机物、醛、蛋白 质、糖类、脂类、核酸、酶等 (一)、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来,固定细胞的方法有 物理固定:如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片 2.化学固定:如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 27 并取得了丰硕成果。 图 2-20 尼康 NT-88NE 显微操作/注射仪 （图片来自 http://www.nikon.com） 第二节 生物化学与分子生物学技术 现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的， 没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。 一、细胞化学技术 组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染 色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究 的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白 质、糖类、脂类、核酸、酶等。 （一）、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有： 1． 物理固定：如血膜空气快速干燥、冷冻干燥或直接冷冻切片。 2． 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活 性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此,要根据实验要求和组化反应,选 择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定,而显示酶类多用甲醛丙 酮缓冲液固定。 (二)、显示方法 1.金属沉淀法:利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀,借以辨认所检査的 物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后,反应产物最终生成CoS或PbS 有色沉淀,而显示出酶活性。 2.偶氮偶联法:酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3.Schf反应:细胞中的醛基可使Sch试剂中的无色品红变为红色。这种反应通 常用于显示糖和脱氧核糖核酸( Feulgen反应) 4.联苯胺反应:过氧化氢酶分解H202。产生新生氧,后者再将无色的联苯胺氧化 成联苯胺蓝,进而变成棕色化合物。 5.普鲁士蓝反应:三价铁与酸性亚铁氰化钾作用,形成普鲁士蓝。 6. Formazane反应:显示脱氢酶。 7.“Nad反应:显示细胞色素氧化酶 8.脂溶染色法:借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色 9.茚三酮反应:显示蛋白质 二、免疫细胞化学 免疫细胞化学( immunocytochemistry)是根据免疫学原理,利用抗体同特定 抗原专一结合,对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合 的小分子;抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的Y球蛋白。如果将抗体结合上 标记物,再与组织中的抗原发生反应,即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组 织中的部位。 常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法 ( immunofluorescent technique)常用的萤光素有异硫氰酸荧光素( fluorescein isothiocyanate)、罗丹明( rhodamine)等。酶标记的称为酶标免疫法 ( enzyme-labeled antibody method),常用的酶有辣根过氧化物酶( horseradish peroxidase),酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物,从而显示出抗原存在的部 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种,直接法是将带有标记的抗 体与抗原反应,显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础 上,再用带标记的次级抗体同初级抗体反应,从而使初级反应得到放大,显示增强
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 28 和其中的某些化学物质加以固定保存。不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活 性的影响、保存结构的细腻度均不相同。因此，要根据实验要求和组化反应，选 择最佳的固定方法和固定剂。如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙 酮缓冲液固定。 （二）、显示方法 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的 物质或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成 CoS 或 PbS 有色沉淀，而显示出酶活性。 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff 反应：细胞中的醛基可使 Schiff 试剂中的无色品红变为红色。这种反应通 常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen 反应）。 4. 联苯胺反应：过氧化氢酶分解 H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化 成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane 反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质。 二、免疫细胞化学 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定 抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合 的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的 γ 球蛋白。如果将抗体结合上 标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组 织中的部位。 常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法 （immunofluorescent technique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate ）、 罗 丹 明 （ rhodamine ）等。酶标记的称为酶标免疫法 （enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部 位。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗 体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础 上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强