细胞生物学教程 http://www.cella.cn R=0.61A/N.A.N.A n sina/2 式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),NA.=镜口率 ( numeric aperture)。镜口角总是要小于180,所以sina/2的最大值必然小于1 表21及中介质的折射率 介质 空气 香柏油 α溴萘 折射率 1.33 1515 1.66 制作光学镜头所用的玻璃折射率为165~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃 的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香 柏油为介质,镜口率可接近15。 普通光线的波长为400-700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于02μm,人 眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X (二)、荧光显微镜 图2-2尼康E800荧光DC显微镜 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身 虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光, 荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 14 R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率 （numeric aperture）。镜口角总是要小于 180˚ ，所以 sina/2 的最大值必然小于 1。 表 2-1 及中介质的折射率 介质 空气 水 香柏油 α 溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66 制作光学镜头所用的玻璃折射率为 1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃 的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜头用香 柏油为介质，镜口率可接近 1.5。 普通光线的波长为 400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于 0.2µm，人 眼的分辨力是 0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为 1000X。 （二）、荧光显微镜 图 2-2 尼康 E800 荧光 DIC 显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身 虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光， 荧光显微镜（图 2-2，3，4）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 人 33 second barrier filter: cuts out wanted fluorescent signals, 4 LIGHT 520 and 560 nm SOURCE ght below 510 nm but transmits light above 510 nm 1 first barrier filter: lets through between 450 and 490 nm objective lens 图2-3落射式照明原理 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别: 1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3); 2.光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜 有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除 紫外线,用以保护人目 图2-4荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自htp/ vww itg uiuc. edu
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 15 图 2-3 落射式照明原理 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图 2-3）； 2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除 紫外线，用以保护人目。 图 2-4 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），图片来自 http://www.itg.uiuc.edu
细胞生物学教程 http://www.cella.cn (三)、激光共聚焦扫描显微境 图2-5激光共聚焦扫描显微镜 图2-6LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自htp/www.iteuiucedu 激光共聚焦扫描显微镜( laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用 激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用 个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波 长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显 微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时, 就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 16 （三）、激光共聚焦扫描显微境 图 2-5 激光共聚焦扫描显微镜 图 2-6 LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管，图片来自 http://www.itg.uiuc.edu 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope，图 2-5、6）用 激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一 个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波 长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显 微镜的 3 倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时， 就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分 的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 (四)、暗视野显微镜 暗视野显微镜( dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照 明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背 景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-~200nm的微粒子, 分辨率可比普通显微镜高50倍 Objective lens Condenser Light Dark-field stop 图2-7暗视野照明方式 (五)、相差显微镜 相差显微镜( phasecontrast microscope,图28、9)由P. Zernike于1932 年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经 染色的标本和活细胞 相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提 高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射, 偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程 差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅増大或减下,提高反差。在构造上,相
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 17 分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分 的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 （四）、暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope，图 2-7）的聚光镜中央有当光片，使照 明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背 景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm 的微粒子， 分辨率可比普通显微镜高 50 倍。 图 2-7 暗视野照明方式 （五）、相差显微镜 相差显微镜（phasecontrast microscope，图 2-8、9）由 P．Zernike 于 1932 年发明，并因此获 1953 年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经 染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提 高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射， 偏离了原来的光路，同时被延迟了 1/4λ（波长），如果再增加或减少 1/4λ，则光程 差变为 1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: 1.环形光阑( annular diaphragm)位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光 器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。 2.相位板( annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光 或衍射光的相位推迟1/4A。分为两种 1.A相板:将直射光推迟1/4入,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本 结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。 2.B相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成 暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗 Phase Contrast Light Pathways Annular. L 图2-8相差显微镜照明原理 图29一种介壳虫的染色体(PCM照片)
细胞生物学教程 http://www.cella.cn 18 差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1. 环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光 器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 2. 相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光 或衍射光的相位推迟 1/4λ。分为两种： 1. A+ 相板：将直射光推迟 1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本 结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2. B+ 相板：将衍射光推迟 1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成 暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 图 2-8 相差显微镜照明原理 图 2-9 一种介壳虫的染色体（PCM 照片）