生命科学学院《细胞生物学实验》（如酒精，乙醚，稀释剂等）。因为会腐蚀机械和油漆，造成损坏。3、光学系统的维护保养（1）透镜的清洁：使用后用干净柔软的绸布轻轻擦拭目镜和物镜镜片。有较顽固的污迹，可用长纤维脱脂棉或干净的细棉布蘸少些二甲笨或镜头清洗液（3份酒精：1份乙醚）擦拭，然后用干净细软的绸布擦干。注意：清洗液千万不能渗入到物镜镜片内部，否则会损坏物镜镜片。纯酒精和二甲苯容易燃烧，在将电源开关打开或关闭时要特别当心不要引燃这些液体。（2）物镜和目镜的生霉生雾的处理办法：准备30%无水乙醇+70%乙醚，将不同镜头单独分开放置干燥剂器皿中，最好用棉花棒，纱布，柔软的刷子等比较柔软的东西来擦拭油镜当时就要清洗。特别是100X的油镜，处理不当的话，前片容易浸油或开胶。目镜可以自己拆下来清洗，16X目镜注意别装反了，前片凹面在上。物镜不要随便拆下。注意：擦洗镜头时，不能过用力，以防止损伤镀膜层。一般2个月最好能集中保养一次。显微镜多时，各个镜头要标号以免弄错了搭配。4、定期检查：为了保持性能的稳定，建议做定期的检查，保养。综上所述，对于生物显微镜的维护保养，主要做到防尘、防潮、防热、防腐蚀。用后及时清洗擦拭干净，并定期在有关部位加注中性润滑油脂。对于一些结构复杂，装配精密的零部件，如果没有一定的专业知识，一定的技能和专用工具，就不能擅自拆装，以免损坏零部件。二、显微镜的发展史1.显微镜的早期应用19世纪由于显微镜的发明，植物解剖研究也得到复活。虎克，马尔比基，雷文雷克等都曾用显微镜观察到植物细胞，但他们对细胞的理解还没有上升到系统学说的程度。1831年一个伦敦医生发现植物细胞具有细胞核；捷克人浦肯野观察到了母鸡卵中胚核，这些结果由耶拿大学的植物学家马提阿斯·施莱登总结为细胞学说，即细胞是一切植物的基本生命单位。奥多尔·施旺于1939年将细胞学说扩展到动物界，即细胞是一切生命的基本活动单位。细胞学说被恩克斯称为19世纪的三大发明之一，这里充分说明了显微镜作为研究手段对现代生物学和自然科学研究的推动作用。染料的发现和广泛应用提高了显微镜的对比度，使原来看不到的生物结构在显微镜下变得清晰可见。约瑟夫·格拉克(JosephVonGerlach)最早在185815
生命科学学院《细胞生物学实验》 15 （如酒精，乙醚，稀释剂等）。因为会腐蚀机械和油漆，造成损坏。 3、光学系统的维护保养 （1）透镜的清洁：使用后用干净柔软的绸布轻轻擦拭目镜和物镜镜片。 有较顽固的污迹，可用长纤维脱脂棉或干净的细棉布蘸少些二甲笨或镜头清洗 液（3 份酒精∶1 份乙醚）擦拭，然后用干净细软的绸布擦干。 注意：清洗液千万不能渗入到物镜镜片内部，否则会损坏物镜镜片。纯酒 精和二甲苯容易燃烧，在将电源开关打开或关闭时要特别当心不要引燃这些液 体。 （2）物镜和目镜的生霉生雾的处理办法 ：准备 30%无水乙醇+70%乙 醚，将不同镜头单独分开放置干燥剂器皿中，最好用棉花棒，纱布，柔软的刷 子等比较柔软的东西来擦拭油镜当时就要清洗。特别是 100X 的油镜，处理不 当的话，前片容易浸油或开胶。目镜可以自己拆下来清洗，16X 目镜注意别装 反了，前片凹面在上。物镜不要随便拆下。 注意：擦洗镜头时，不能过用力，以防止损伤镀膜层。一般 2 个月最好能 集中保养一次。显微镜多时，各个镜头要标号以免弄错了搭配。 4、定期检查： 为了保持性能的稳定，建议做定期的检查，保养。综上所述，对于生物显 微镜的维护保养，主要做到防尘、防潮、防热、防腐蚀。用后及时清洗擦拭 干净，并定期在有关部位加注中性润滑油脂。对于一些结构复杂，装配精密 的零部件，如果没有一定的专业知识，一定的技能和专用工具，就不能擅自 拆装，以免损坏零部件。 二、显微镜的发展史 1.显微镜的早期应用 19 世纪由于显微镜的发明，植物解剖研究也得到复活。虎克，马尔比基， 雷文雷克等都曾用显微镜观察到植物细胞，但他们对细胞的理解还没有上升到 系统学说的程度。 1831 年一个伦敦医生发现植物细胞具有细胞核；捷克人浦肯野观察到了母 鸡卵中胚核，这些结果由耶拿大学的植物学家马提阿斯﹒施莱登总结为细胞学 说，即细胞是一切植物的基本生命单位。奥多尔﹒施旺于 1939 年将细胞学说 扩展到动物界，即细胞是一切生命的基本活动单位。细胞学说被恩克斯称为 19 世纪的三大发明之一，这里充分说明了显微镜作为研究手段对现代生物学 和自然科学研究的推动作用。 染料的发现和广泛应用提高了显微镜的对比度，使原来看不到的生物结构 在显微镜下变得清晰可见。约瑟夫﹒格拉克(Joseph Von Gerlach)最早在 1858
生命科学学院《细胞生物学实验》年用胭脂红(Carmine)溶液对脑组织染色，格拉克发现不同细胞组份对染料有不同吸收。1873年卡密罗：高尔基（CamilloGolgi，他不是苏联文学学家马克西姆·高尔基)开创了银染的方法，圣地牙哥·拉蒙-卡哈尔(SantiagoRam6nyCajal)用高尔基的染色方法开创了大脑微观结构的研究，卡哈尔精于素描，他的很多作品直到现在还在使用。荧光染料的出现极大的提高了对比度，然而荧光显微镜的发展却落后于荧光染料，正如宝剑在手却苦于没有用剑的高手。1871年约翰·弗雷德里克威廉·阿道夫·冯·拜尔（JohannFriedrichWilhelmAdolfvonBaeyer）首先分析出吲哚结构并合成荧光素(fluorescein)，因此获1905年诺贝尔化学奖。1961年阿尔伯特：库恩斯(AlbertCoons)将荧光素藕联到抗体上，抗体只结合特异性的抗原分子，不仅提高了标记的特异性，又因为荧光染料的应用提高了对比度，开创了免疫荧光显微镜的新纪元。1962年Shimomura发现了绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白基因1992被Prasher克隆出来。1995年华裔诺贝尔奖得主钱永健发现了一个荧光更强，光稳定更好的突变体。钱永健的突变体将激发光波长从紫外延展到了488nm的可见光区间，从1994年开始绿色荧光蛋白被广泛用于细胞内蛋白质的定位和表达。2.显微镜在20世纪早期的发展1903年奥地利籍匈牙利裔化学家里夏德·阿道夫·席格蒙迪（RichardAdolfZsigmondy)发明了超显微镜，用来观察气体或胶体中的粒子。席格蒙迪命名为超级，因为它可以研究尺度在波长以下的物体，超的意思就是超出了波长的限制，而不是超级的意思，并于1925年获得了诺贝尔化学奖。席格蒙迪1897年加入了由Abbe与肖特(SchottGlaswerkeAG)成立的肖特玻璃制造厂，在该厂工作期间，席格蒙迪对茶色玻璃进来了研究，还发明了一种玻璃，命名为“JenaerMilchglas”。1890年席格蒙迪辞职，与蔡司合作研制了狭缝超显微镜，席格蒙迪可以测出玻璃中4纳米的颗粒。1907年他进入格丁根大学，成为有机化学教授，直至1929年2月退休，席格蒙迪一生的主要成就在于确立了现代胶体化学的基础。1932年弗里茨·塞尔尼克(FritsZernike)发明了相位差显微镜来研究无色和透明的生物样品，这样细胞不再需要染色，寒尔尼克因此获得了1953年诺贝尔物理学奖。然而在相位差显微镜刚被发明时并没有得到足够多的重视，塞尔尼克与蔡司公司讨论过合作的可能性，但蔡司当时不敢兴趣。直到二次世界大战时塞尔尼克被纳粹党速捕，媒体的报道将塞尔尼克再次推倒前台，相位差16
生命科学学院《细胞生物学实验》 16 年用胭脂红(Carmine)溶液对脑组织染色，格拉克发现不同细胞组份对染料有 不同吸收。1873 年卡密罗﹒高尔基(Camillo Golgi，他不是苏联文学学家马克 西姆﹒高尔基)开创了银染的方法，圣地牙哥﹒拉蒙-卡哈尔(Santiago Ramón y Cajal)用高尔基的染色方法开创了大脑微观结构的研究，卡哈尔精于素描，他 的很多作品直到现在还在使用。 荧光染料的出现极大的提高了对比度，然而荧光显微镜的发展却落后于荧 光染料，正如宝剑在手却苦于没有用剑的高手。1871 年约翰﹒弗雷德里克﹒ 威廉﹒阿道夫﹒冯﹒拜尔（Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer）首先分 析出吲哚结构并合成荧光素(fluorescein)， 因此获 1905 年诺贝尔化学奖。 1961 年阿尔伯特﹒库恩斯(Albert Coons)将荧光素藕联到抗体上，抗体只结合 特异性的抗原分子，不仅提高了标记的特异性，又因为荧光染料的应用提高了 对比度，开创了免疫荧光显微镜的新纪元。 1962 年 Shimomura 发现了绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白基因 1992 被 Prasher 克隆出来。1995 年华裔诺贝尔奖得主钱永健发现了一个荧光更强，光 稳定更好的突变体。钱永健的突变体将激发光波长从紫外延展到了 488nm 的 可见光区间，从 1994 年开始绿色荧光蛋白被广泛用于细胞内蛋白质的定位和 表达。 2.显微镜在 20 世纪早期的发展 1903 年奥地利籍匈牙利裔化学家里夏德﹒阿道夫﹒席格蒙迪(Richard Adolf Zsigmondy)发明了超显微镜，用来观察气体或胶体中的粒子。席格蒙迪 命名为超级，因为它可以研究尺度在波长以下的物体，超的意思就是超出了波 长的限制，而不是超级的意思，并于 1925 年获得了诺贝尔化学奖。 席格蒙迪 1897 年加入了由 Abbe 与肖特(Schott Glaswerke AG)成立的肖特 玻璃制造厂，在该厂工作期间，席格蒙迪对茶色玻璃进来了研究，还发明了一 种玻璃，命名为“Jenaer Milchglas”。1890 年席格蒙迪辞职，与蔡司合作研 制了狭缝超显微镜，席格蒙迪可以测出玻璃中 4 纳米的颗粒。1907 年他进入 格丁根大学，成为有机化学教授，直至 1929 年 2 月退休，席格蒙迪一生的主 要成就在于确立了现代胶体化学的基础。 1932 年弗里茨﹒塞尔尼克(Frits Zernike)发明了相位差显微镜来研究无色 和透明的生物样品，这样细胞不再需要染色，塞尔尼克因此获得了 1953 年诺 贝尔物理学奖。然而在相位差显微镜刚被发明时并没有得到足够多的重视，塞 尔尼克与蔡司公司讨论过合作的可能性，但蔡司当时不敢兴趣。直到二次世界 大战时塞尔尼克被纳粹党逮捕，媒体的报道将塞尔尼克再次推倒前台，相位差
生命科学学院《细胞生物学实验》显微镜才得到重视。塞尔尼克的侄子Gerardus'tHooft也是著名的物理学家，Hooft解释了电弱相互作用的量子结构而获得1999年诺贝尔物理奖。极化/偏振显微镜（polarizationmicroscopy)也是一种非标记技术，由德国物理学家马克·贝雷克(MarkBerek)在二次世界大战前发明，具体年月不详。虽然当时人们已经开始使用荧光显微镜，但因为荧光显微镜的样品需要固定染色，所以荧光显微镜观察到的亚细胞结构存在很大争议，很多人认为那是染料造成的假象，非标记显微镜观察到的结构更容易获得认可。W.J.Schmid在1937年观察到了纺锤体的纤维状结构，但图像有些模糊不清。1953年ShinyaInoué用自制的改进型偏振显微镜证实了Schmid的发现，通过与荧光显微镜的结果比较，二者结果相似，这也在一定程度上推动了荧光显微镜的发展。20世纪50年乔治·诺马尔斯基(GeorgesNomarski)发明了微分干涉相衬显微镜(differentialinterferencecontrast)，微分干涉相衬显微镜可以用来研究非染色的活生物样品。微分干涉相衬显微镜要求透明样品的折射率与样品所处的介质环境相同，而且不能研究厚的或者有色素的样品，但微分干涉相衬显微镜的分辩率在合适的条件下可以比相位差显微镜更高。Allen1981年将摄像机(videocamera)技术与微分干涉相衬显微镜整合成视频增强对比微分干涉相衬显徽镜(Video-enhancedContrast，DifferentialInterferenceContrast(AVEC-DIC)microscopy)，当然摄像机也可以与偏振显微镜整合成视频增强对比偏振显微镜(Video-enhanced Contrast Polarization Microscopy)。1940年西奥多·弗斯特(TheodorFoster)发现了荧光共振能量转移现象(fluorescenceresonanceenvergytransfer，FRET)，弗斯特证实电子激发能量能够从荧光供体(donorfluorescence)转到荧光受体(acceptorchromophore)，转移的效率与分子距离的六次方的倒数相关。FRET显微镜可以用来研究蛋白在体内的相互作用，1996年韩国学者TaekjipHa首次实现了单分子FRET，目前单分子FRET可以在体外实时研究分子相互作用和分子动态变化。3.电子显微镜的发展电子显微镜的发展却是建立在光学显微镜的基础上，在现代科学发展的历史中，两个看似无关的学科互相融合往往产生意想不到的结构。可见光的分辩率极限是0.2微米，小于0.2微米的结构在普通光学显微镜下是无法识别的。提高显微镜分辨率的途径之一是设法减小光的波长，或者用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，用磁场聚焦电子束，就有可能用电子束来放大物体。17
生命科学学院《细胞生物学实验》 17 显微镜才得到重视。塞尔尼克的侄子 Gerardus't Hooft 也是著名的物理学家， Hooft 解释了电弱相互作用的量子结构而获得 1999 年诺贝尔物理奖。 极化/偏振显微镜(polarization microscopy)也是一种非标记技术，由德国物 理学家马克﹒贝雷克(Mark Berek)在二次世界大战前发明，具体年月不详。虽 然当时人们已经开始使用荧光显微镜，但因为荧光显微镜的样品需要固定染 色，所以荧光显微镜观察到的亚细胞结构存在很大争议，很多人认为那是染料 造成的假象，非标记显微镜观察到的结构更容易获得认可。W.J.Schmid 在 1937 年观察到了纺锤体的纤维状结构，但图像有些模糊不清。1953 年 Shinya Inoué用自制的改进型偏振显微镜证实了 Schmid 的发现，通过与荧光显微镜 的结果比较，二者结果相似，这也在一定程度上推动了荧光显微镜的发展。 20 世纪 50 年乔治﹒诺马尔斯基(Georges Nomarski)发明了微分干涉相衬显 微镜(differential interference contrast)，微分干涉相衬显微镜可以用来研究非染 色的活生物样品。微分干涉相衬显微镜要求透明样品的折射率与样品所处的介 质环境相同，而且不能研究厚的或者有色素的样品，但微分干涉相衬显微镜的 分辩率在合适的条件下可以比相位差显微镜更高。Allen1981 年将摄像机(video camera)技术与微分干涉相衬显微镜整合成视频增强对比微分干涉相衬显微镜 (Video-enhanced Contrast， Differential Interference Contrast (AVEC-DIC) microscopy)，当然摄像机也可以与偏振显微镜整合成视频增强对比偏振显微镜 (Video-enhanced Contrast Polarization Microscopy)。 1940 年西奥多﹒弗斯特(Theodor Föster)发现了荧光共振能量转移现象 (fluorescence resonance envergy transfer， FRET)，弗斯特证实电子激发能量能 够从荧光供体(donor fluorescence)转到荧光受体(acceptor chromophore)，转移的 效率与分子距离的六次方的倒数相关。FRET 显微镜可以用来研究蛋白在体内 的相互作用，1996 年韩国学者 Taekjip Ha 首次实现了单分子 FRET，目前单分 子 FRET 可以在体外实时研究分子相互作用和分子动态变化。 3.电子显微镜的发展 电子显微镜的发展却是建立在光学显微镜的基础上，在现代科学发展的历 史中，两个看似无关的学科互相融合往往产生意想不到的结构。可见光的分辩 率极限是 0.2 微米，小于 0.2 微米的结构在普通光学显微镜下是无法识别的。 提高显微镜分辨率的途径之一是设法减小光的波长，或者用电子束来代替光。 根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，“波 长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，用磁场聚焦电子束，就有可能 用电子束来放大物体
生命科学学院《细胞生物学实验》1931年，德国的克诺尔和鲁斯卡，用冷阴极放电电子源和三个电子透镜改装了一台高压示波器，获得了放大十几倍的图象，证实了电子显微镜放大成像的可能性。1932年，经过鲁斯卡的改进，电子显微镜的分辨能力达到了50纳米，大概是当时光学显微镜分辨率的十倍，于是电子显微镜开始受到人们的重视。二十世纪40年代，美国人希尔用消像散器克服了电子透镜旋转不对称性的负面影响，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代电子显微镜的水平。我们国家的科研工作者高瞻远瞩紧跟世界科研潮流，在1958年成功研制出透射式电子显微镜，分辨本领为3纳米，1979年又制成分辨本领为0.3纳米的大型透射电子显微镜。由于分辨率太低而且电子束对样品损伤严重，此时的电子显微镜并不适合去观测单个分子。随着上世纪80年代扫描隧道显微镜和原子力显微镜的问世，在表面上检测单个原子或分子终于成为可能。1952年，英国工程师CharlesOatley制造出了第一台扫描电子显微镜(SEM)，电子显微镜被认为是20世纪最重要的发明之一。很多在可见光下看不见的物体一一例如病毒一一在电子显微镜下都现出了原形。1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家GerdBinnig和HeinrichRohrer发明了扫描隧道显微镜(STM)。这种显微镜比电子显微镜更加激进，它完全失去了传统显微镜的概念。扫描隧道显微镜的工作原理是“隧道效应”。隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压，如果探针距离物体表面很近一大约在纳米级的距离上一隧道效应就会起作用。电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。因为这项奇妙的发明，Binnig和Rohrer获得了1986年诺贝尔物理学奖，电子显微镜的发明者Ruska在同一年与他们共享了诺贝尔物理学奖。电子显微镜在细胞生物学中的应用奠定了现代细胞生物学的基础，很多细胞的超微结构都是在电子显微镜的帮助下实现的。20世纪后半段是电子显微镜发展的黄金期，比如罗马尼亚出生的美国细胞生物学家乔治·埃米尔·帕拉德（GeorgeEmilPalade)借助电子显微镜的帮助在1995年发现了核糖体，核糖体是细胞内蛋白质翻译的工厂，核糖体的发现对我们认识细胞功能迈出了重大的一步，因此帕拉德于1974年被授予诺贝尔医学奖。工欲善其事必先利其器，帕拉德的贡献就是拜电子显微镜所赐18
生命科学学院《细胞生物学实验》 18 1931 年，德国的克诺尔和鲁斯卡，用冷阴极放电电子源和三个电子透镜 改装了一台高压示波器，获得了放大十几倍的图象，证实了电子显微镜放大成 像的可能性。 1932 年，经过鲁斯卡的改进，电子显微镜的分辨能力达到了 50 纳米，大 概是当时光学显微镜分辨率的十倍，于是电子显微镜开始受到人们的重视。 二十世纪 40 年代，美国人希尔用消像散器克服了电子透镜旋转不对称性 的负面影响，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代电子显 微镜的水平。 我们国家的科研工作者高瞻远瞩紧跟世界科研潮流，在 1958 年成功研制 出透射式电子显微镜，分辨本领为 3 纳米，1979 年又制成分辨本领为 0.3 纳米 的大型透射电子显微镜。由于分辨率太低而且电子束对样品损伤严重，此时的 电子显微镜并不适合去观测单个分子。随着上世纪 80 年代扫描隧道显微镜和 原子力显微镜的问世，在表面上检测单个原子或分子终于成为可能。 1952 年，英国工程师 Charles Oatley 制造出了第一台扫描电子显微镜 (SEM)，电子显微镜被认为是 20 世纪最重要的发明之一。很多在可见光下看 不见的物体——例如病毒——在电子显微镜下都现出了原形。 1983 年，IBM 公司苏黎世实验室的两位科学家 Gerd Binnig 和 Heinrich Rohrer 发明了扫描隧道显微镜(STM)。这种显微镜比电子显微镜更加激进，它 完全失去了传统显微镜的概念。扫描隧道显微镜的工作原理是“隧道效应”。 隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压，如果 探针距离物体表面很近—大约在纳米级的距离上—隧道效应就会起作用。电子 会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离 发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体 表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。因为这项奇妙的发明，Binnig 和 Rohrer 获得了 1986 年诺贝尔物理学奖，电子显微镜的发明者 Ruska 在同一 年与他们共享了诺贝尔物理学奖。 电子显微镜在细胞生物学中的应用奠定了现代细胞生物学的基础，很多细 胞的超微结构都是在电子显微镜的帮助下实现的。20 世纪后半段是电子显微 镜发展的黄金期，比如罗马尼亚出生的美国细胞生物学家乔治﹒埃米尔﹒帕拉 德(George Emil Palade)借助电子显微镜的帮助在 1995 年发现了核糖体，核糖 体是细胞内蛋白质翻译的工厂，核糖体的发现对我们认识细胞功能迈出了重大 的一步，因此帕拉德于 1974 年被授予诺贝尔医学奖。工欲善其事必先利其 器，帕拉德的贡献就是拜电子显微镜所赐
生命科学学院《细胞生物学实验》虽然电子显微镜的分辨本领早已远胜光学显微镜，但因为电子显微镜要在真空条件下工作，所以很难观察活生物，而且电子束照射会使生物样品受到辐照损伤。教学反思要注重学生已有知识的迁移，留意学生已有操作习惯的缺陷，注意矫正，并在现有1.操作时间内，形成标准的操作习惯。2.注意培养学生利用显微镜观察微观样本的习惯和方法。循序渐进的帮助学生习惯在显微镜下耐心、细心的进行观察。19
生命科学学院《细胞生物学实验》 19 虽然电子显微镜的分辨本领早已远胜光学显微镜，但因为电子显微镜要在 真空条件下工作，所以很难观察活生物，而且电子束照射会使生物样品受到辐 照损伤。 教学反思 1. 要注重学生已有知识的迁移，留意学生已有操作习惯的缺陷，注意矫正，并在现有 操作时间内，形成标准的操作习惯。 2. 注意培养学生利用显微镜观察微观样本的习惯和方法。循序渐进的帮助学生习惯在 显微镜下耐心、细心的进行观察