第23卷第3期 云南农业大学学报 Vol 23 No3 2008年5月 Joumal ofY unnan A griculturalUn iversity M四2008 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂交研究 林良斌，马占强2，张传利，刘雅婷，毛孝强，厦国银'，马忠琴1 (1云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明65020L2河南科技大学生命科学学院，河南洛阳471000) 摘要：以甘蓝型油菜湘油15号和紫罗兰的下胚轴为材料，分离制备原生质体。采用EG-高C·-高H法进 行原生质体融合，在PEG浓度为3，原生质体融合密度为50×10个mL下融合25mi血融合率可达17%。 在附加1.5mg/L24D,0.5mg/LNAA05 mL/LBA的改良的KM8p培养基中，以03moL蔗糖和01mo/ L葡萄糖作渗透稳定剂进行液体浅层培养融合体，培养3~6d细胞发生第1次分裂，7d时统计分裂频率最高为 13.8%,35d后形成大量的细胞团和肉眼可见的小愈伤组织其植板率最高为6%。然后转移到含有01mgL 24D和02 mg /L BA的MS固体培养基上使其增殖。当愈伤组织长至5mm左右时，将其转到含有05mgL BA01mg/LNAA和Q2 mg/LGA,的MS分化培养基上诱导芽分化。当芽长1-2m时，将其切下插入附加 05 mg/L IBA的1/2MS生根培养基上，两周后即可获得完整植株。细胞学鉴定表明获得了杂种植株。 关键词：甘蓝型油菜；紫罗兰；原生质体：体细胞杂交；植株再生 中图分类号：S56540353文献标识码：A文章编号：1004-390N(2008)03-0295-07 Studies on Somatic Hybridization betw een Brassica napus andM althiola incana B.Br LN Lang-bn',MA Zhanq ing',ZHANG C huanl,LU Ya-ting'. MAO Xio-q ing,XH Guo-y n,MA Zhongqn (1 Faculty of Agmonon y and B itechnology Yunnan Agricultural University Kumm ng 650201,China 2 Facu lty of Life Science Henan Scence and Technology Un iversity Luoyang 471000 Chna) Abstract Protoplast iso lated fiom hypocoty ls of cultivar Brassica nopus X angyou 15 and Malthiola incana B Brwere fiused by hem ethod of PEGH igh CaH gh pH and the h ghest fusion frequency 17%was obta ned w hile fusion so ltion contained 30%PEG and fusion w as carred out at the den- sity of5.0x 10 potop lasts /mL for 25m n The fusion-protoplasts were then cultured by "thn liquid layer"method in ipoved KM8p medim supplemented w ih 1.5mg/L 2 4-D,0.5mg/L NAA and 0.5ml/L BA,0.3 mol/L sucrose and 0.I mol/L glucose hat both were used as osmotic regu lator The fisin-potop lasts started to d ivide after 3~6 days and the div ision frequency was 13.8%after beng cultured for 7 days The cellmasses and small calluses could be obtaned after 35 days and the plating efficiency was6.3,then transferred to the poliferation MS medim supp l ented wih 0.1 mg/L 2 4-D and 0.2mg/L BA.Calluses of 5mm n d ia eter w ere transferred on MS d ifferentatin medim supplem ented w ith 0.5mg/L BA,0.1mg/L NAA and 0.2mg/L GA3 and whole plantswere obtaned after transferring 1~2 a shoots to 1/2 MS medium w ih 0.5mg/L IBA for 2 weeks Cytobgy ilentificatins shown that hybrid plantsw ere obtaned Key words Brassica napus Malthio la incna protoplast som atic hybridization p lant regenerat in 收稿日期：2007-05-08 *基金项目：云南省自然科学基金(2004C0035M) e作者简介i林良林A3止男.南武风i载授1韩要从事神来生物技术点德传育种小www.cnki.net ,男，湖南武冈人，教授，博士，主要从事油菜生物技术与遗传育种
第 23卷 第 3期 云南农业大学学报 Vo l 23 No3 2008年 5月 Journa l o fYunnan A griculturalUn iversity M ay 2008 收稿日期: 2007- 05- 08 * 基金项目: 云南省自然科学基金 ( 2004C0035M ) 作者简介: 林良斌 ( 1963- ) , 男, 湖南武冈人, 教授, 博士, 主要从事油菜生物技术与遗传育种。 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂交研究 * 林良斌 1 , 马占强 2 , 张传利 1 , 刘雅婷 1 , 毛孝强 1 , 厦国银 1 , 马忠琴 1 ( 1. 云南农业大学农学与生物技术学院, 云南 昆明 650201; 2. 河南科技大学生命科学学院, 河南 洛阳 471000) 摘要: 以甘蓝型油菜湘油 15号和紫罗兰的下胚轴为材料, 分离制备原生质体。采用 PEG -高 Ca 2+ - 高 pH 法进 行原生质体融合, 在 PEG浓度为 30% , 原生质体融合密度为 50 10 5个 /mL下融合 25 m in, 融合率可达 17% 。 在附加 15m g /L 2, 4D, 05m g /L NAA, 05mL /L BA的改良的 KM8p培养基中, 以 03m o l/L蔗糖和 01 mo l/ L葡萄糖作渗透稳定剂进行液体浅层培养融合体, 培养 3~ 6 d细胞发生第 1次分裂, 7 d时统计分裂频率最高为 138% , 35 d后形成大量的细胞团和肉眼可见的小愈伤组织, 其植板率最高为 65% 。然后转移到含有 01 mg /L 2, 4D和 0 2mg /L BA的 M S固体培养基上使其增殖。当愈伤组织长至 5 mm 左右时, 将其转到含有 05 mg /L BA, 01 mg /L NAA和 02 mg /L GA3 的 MS分化培养基上诱导芽分化。当芽长 1~ 2 cm 时, 将其切下插入附加 05 mg /L IBA的 1/2MS生根培养基上, 两周后即可获得完整植株。细胞学鉴定表明获得了杂种植株。 关键词: 甘蓝型油菜; 紫罗兰; 原生质体; 体细胞杂交; 植株再生 中图分类号: S 565 4035 3 文献标识码: A 文章编号: 1004- 390X ( 2008) 03- 0295- 07 Studies on Somatic Hybridization between Brassica napus andMalthiola incana BBr LIN L ia ng b in 1 , MA Zhanq ia ng 2 , ZHANG C hua nli 1 , LIU Ya ting 1 , MAO Xiao q ia ng 1 , XIA G uoy in 1 , MA Zho ng q in 1 ( 1. Faculty o f Ag ronom y and B io techno logy, Yunnan Agricultural University, Kunm ing 650201, China; 2. Facu lty of Life Science, H enan Sc ience and TechnologyUn ive rsity, Luoyang 471000, Ch ina) Abstract: Protoplast iso lated from hypocoty ls of cultivar Brassica napus. X iangyou 15 and M althiola incana B. B rw ere fused by them ethod o f PEGH igh Ca 2 + H igh pH and the h ighest fusion frequency ( 17% ) w as obta ined w h ile fusion so lution contained 30% PEG and fusion w as carried out at the den sity o f 50 10 5 pro top lasts /mL for 25m in. The fusionprotoplasts w ere then cu ltured by th in liquid layer! method in improved KM 8p medium supplemented w ith 15 mg /L 2, 4D, 05mg /L NAA and 05m l/L BA , 03 mo l/L sucrose and 01 mo l/L glucose that both w ere used as osmotic regu lator. The fusionpro top lasts started to d iv ide after 3~ 6 days, and the div ision frequency was 138% after be ing cu ltured for 7 days. The cellmasses and small calluses could be obta ined after 35 days, and the plating efficiency w as 65%, then transferred to the pro liferation M S med ium supp lem ented w ith 01 mg /L 2, 4D, and 02mg /L BA. C alluses of 5mm in d iam eterw ere transferred onM S d ifferentia tion medium supplemented w ith 05mg /L BA, 01mg /L NAA and 02mg /L GA3, and whole plantsw ere obta ined after transferring 1~ 2 cm shoo ts to 1 /2 MS medium w ith 05mg /L IBA for 2 w eeks. Cyto logy identifica tions shown that hybrid plantsw ere obta ined. K ey words: Brassica napus; M althio la incana; pro toplas;t som atic hybridization; p lant regeneration
296 云南农业大学学报 第23卷 油菜栽培种遗传基础狭窄，限制了其育种。 5mm用CPW-21S(含21%蔗糖)悬浮沉淀。 在芸墓属其它植物或近缘属植物中可利用的基因 两者原生质体产量均用血球计数板记数，原生质 资源十分丰富。因此，通过远缘有性杂交或原生 体活力测定用0.%的伊文斯蓝染色检测，以未 质体融合可将其有益基因导入到栽培油菜中，创 染色的原生质体占观察总数原生质体的百分数 造出油菜育种的新种质。紫罗兰(Malhiola inc- 表示。 naB.Br)是十字花科紫罗兰属植物.原产于地中 1.2.3原生质体的融合及融合体的培养 海，可供观赏用，据中国植物志报道，其花可入 原生质体融合采用高Ca-高H法、 药，有泻下、通经功效。花色不象油菜较单一， PEG法和PEG-高Ca2-高H法。融合体分 有玫瑰红、桃红、淡黄、纯白和雪青等；全株被 别用改良的KM8p、B5”和1/2MS培养基进 灰色星状柔毛，不易受虫害。种子油富含ω一3- 行液体浅层培养。每皿加入2mL培养基进行悬 亚麻酸，为保健珍品，是新型特用油料植物。 浮，用Palfim胶带封口，在(26士1)℃下黑暗培 可见，紫罗兰具有改变油菜的花色，提高油菜的 养。每隔2d观察融合体的分裂，待融合体再生 抗虫性，改善油菜品质等优良基因资源。油菜和 细胞完成几次分裂后，移于弱光(200k)下培 紫罗兰的远缘有性杂交高度不亲和，严重限制 养，1周时观察融合体的分裂频率。每隔一周向 了其有益基因资源的利用。为此，笔者以湘油15 各个培养皿中加0.5mL新鲜培养基，新鲜培养基 号和紫罗兰为材料，进行其原生质体对称融合的 的渗透压稳定剂浓度逐渐降低，以便再生细胞壁 研究，旨在建立起甘蓝型油菜与紫罗兰下胚轴细 的细胞生长。 胞对称融合及植株再生的技术体系，期望将紫罗 1.2.4愈伤组织的形成与诱导分化 兰的有益基因导入到栽培油菜中，创造出油菜育 当培养皿中出现肉眼可见的愈伤组织后，统 种新种质。 计植板率，再将其转移到增殖培养基上，以促进 愈伤组织的进一步生长。待愈伤组织长至直径为 1材料和方法 0.5~1m时，将其转移到分化培养基中诱导不 1.1材料 定芽分化。培养条件都为25℃，光照12h/d光 湘油15号(X ngyou15),种子由湖南农业 强为1000k。 大学油料所提供； 1.2.5不定芽的生根 紫罗兰(Malthiola incana B.Br),种子采自 当不定芽长至1~2am时将其切下，插入含 云南思茅地区。 有0.5 mg/L IBA的1/2MS生根培养集中诱导生 1.2方法 根，形成再生植株。 1.21无菌苗体系的建立 1.26杂种愈伤组织的细胞学检测 湘油15号和紫罗兰种子在水中浸泡1h后， 取0.5mm左右大小疏松的愈伤组织于10mL 用70%(VN)乙醇表面消毒1min再用0.% 的离心管中，加入5mL0.1%a-溴萘溶液，处 (WN)的升汞溶液消毒12mn无菌水漂洗4 理3h。然后100g离心5mn弃取上清液后，加 次，接种于不含任何激素的MS固体培养基上， 蒸馏水悬浮、离心5mn重复3次，加入卡诺氏 萌发出苗。培养条件湘油15号为25℃.光照14 固定液(93%乙醇3份+冰醋酸1份)固定20h。 h/d紫罗兰为20℃黑暗培养4d后转到25℃ 再用蒸馏水离心洗涤3次，用60℃预热过的1N 光照14h/d培养。光照强度都为2000k 盐酸解离6mn蒸馏水洗净后用卡宝品红染色液 1.22原生质体的制备 染色3~5mn压片、镜检并照相。 紫罗兰原生质体分离和纯化参照马占强等) 1.2.7再生植株的细胞学鉴定 的方法：湘油15号原生质体的制备方法类似紫罗 待再生植株的根长至1~2m时，取其根尖， 兰的，但取材为培养8d无菌苗的下胚轴，酶液 用0.%a-溴萘处理2~3h漂洗后用卡诺氏固 1.2%Celluase Onoaka R-10+0.4%Macerozyme 定液固定24。然后用蒸馏水漂洗根尖数次，再 Onoaika R-10+3 mmol/L MES+CPW-10 mol/L 用60℃预热过的1N盐酸解离8mn蒸馏水洗 (出52酶解时间AQh滤液用500他血离心pub1逢后用5宝品红染色液染单m中压片：镜e
油菜栽培种遗传基础狭窄, 限制了其育种。 在芸薹属其它植物或近缘属植物中可利用的基因 资源十分丰富。因此, 通过远缘有性杂交或原生 质体融合可将其有益基因导入到栽培油菜中, 创 造出油菜育种的新种质。紫罗兰 (M althiola inca na BBr) 是十字花科紫罗兰属植物, 原产于地中 海, 可供观赏用, 据中国植物志报道, 其花可入 药, 有泻下、通经功效。花色不象油菜较单一, 有玫瑰红、桃红、淡黄、纯白和雪青等; 全株被 灰色星状柔毛, 不易受虫害。种子油富含 - 3- 亚麻酸 [ 1] , 为保健珍品, 是新型特用油料植物。 可见, 紫罗兰具有改变油菜的花色, 提高油菜的 抗虫性, 改善油菜品质等优良基因资源。油菜和 紫罗兰的远缘有性杂交高度不亲和 [ 2] , 严重限制 了其有益基因资源的利用。为此, 笔者以湘油 15 号和紫罗兰为材料, 进行其原生质体对称融合的 研究, 旨在建立起甘蓝型油菜与紫罗兰下胚轴细 胞对称融合及植株再生的技术体系, 期望将紫罗 兰的有益基因导入到栽培油菜中, 创造出油菜育 种新种质。 1 材料和方法 11 材料 湘油 15号 ( X ingyou 15), 种子由湖南农业 大学油料所提供; 紫罗兰 (M althiola incana BB r. ), 种子采自 云南思茅地区。 12 方法 121 无菌苗体系的建立 湘油 15号和紫罗兰种子在水中浸泡 1 h 后, 用 70% (V /V ) 乙醇表面消毒 1 m in, 再用 01% (W /V ) 的升汞溶液消毒 12 m in, 无菌水漂洗 4 次, 接种于不含任何激素的 M S 固体培养基上, 萌发出苗。培养条件湘油 15号为 25 ∀ , 光照 14 h /d; 紫罗兰为 20 ∀ 黑暗培养 4 d, 后转到 25 ∀ 光照 14 h /d培养。光照强度都为 2 000 lx。 122 原生质体的制备 紫罗兰原生质体分离和纯化参照马占强等 [ 3 ] 的方法; 湘油 15号原生质体的制备方法类似紫罗 兰的, 但取材为培养 8 d无菌苗的下胚轴, 酶液 为 12% CelluaseOnozukaR10+ 04% M acerozyme Onozuka R10 + 3 mmo l/L M ES + CPW 10 mo l/L ( pH 56), 酶解时间 10 h, 滤液用 500 r/m in离心 5m in, 用 CPW - 21S (含 21% 蔗糖 ) 悬浮沉淀。 两者原生质体产量均用血球计数板记数, 原生质 体活力测定用 01% 的伊文斯蓝染色检测, 以未 染色的原生质体占观察总数原生质体的百分数 表示。 123 原生质体的融合及融合体的培养 原生质体融合采用高 Ca 2+ - 高 pH 法 [ 4 ]、 PEG法 [ 5]和 PEG - 高 Ca 2+ - 高 pH 法。融合体分 别用改良的 KM 8p [ 6]、 B5 [ 7]和 1 /2M S [ 8]培养基进 行液体浅层培养。每皿加入 2 mL 培养基进行悬 浮, 用 Palfilm胶带封口, 在 ( 26 # 1) ∀ 下黑暗培 养。每隔 2 d 观察融合体的分裂, 待融合体再生 细胞完成几次分裂后, 移于弱光 ( 200 lx ) 下培 养, 1周时观察融合体的分裂频率。每隔一周向 各个培养皿中加 05mL新鲜培养基, 新鲜培养基 的渗透压稳定剂浓度逐渐降低, 以便再生细胞壁 的细胞生长。 124 愈伤组织的形成与诱导分化 当培养皿中出现肉眼可见的愈伤组织后, 统 计植板率, 再将其转移到增殖培养基上, 以促进 愈伤组织的进一步生长。待愈伤组织长至直径为 05~ 1 cm 时, 将其转移到分化培养基中诱导不 定芽分化。培养条件都为 25 ∀ , 光照 12 h /d、光 强为 1 000 lx。 125 不定芽的生根 当不定芽长至 1~ 2 cm 时将其切下, 插入含 有 05 mg /L IBA 的 1 /2 M S生根培养集中诱导生 根, 形成再生植株。 126 杂种愈伤组织的细胞学检测 取 05 mm左右大小疏松的愈伤组织于 10mL 的离心管中, 加入 5 mL 01% - 溴萘溶液, 处 理 3 h。然后 100 g离心 5m in, 弃取上清液后, 加 蒸馏水悬浮、离心 5 m in, 重复 3次, 加入卡诺氏 固定液 ( 95%乙醇 3份 + 冰醋酸 1份 ) 固定 20 h。 再用蒸馏水离心洗涤 3次, 用 60 ∀ 预热过的 1 N 盐酸解离 6 m in, 蒸馏水洗净后用卡宝品红染色液 染色 3~ 5m in, 压片、镜检并照相。 127 再生植株的细胞学鉴定 待再生植株的根长至 1~ 2 cm 时, 取其根尖, 用 01% - 溴萘处理 2~ 3 h, 漂洗后用卡诺氏固 定液固定 24 h。然后用蒸馏水漂洗根尖数次, 再 用 60 ∀ 预热过的 1 N 盐酸解离 8 m in, 蒸馏水洗 净后用卡宝品红染色液染色 3~ 5 m in, 压片, 镜 296 云南农业大学学报 第 23卷
第3期 林良斌，等：甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 297 检并照相。 C+-高H法3种不同的融合方法进行甘蓝型 油菜和紫罗兰原生质体融合，其效果不同（见表 2结果与分析 )。PEG-高Ca-高H法的总融合率最高， 2.1原生质体的融合 且二源融合率也最高。因此，PEG-高C-高 2.1.1融合方法对原生质体融合的影响 山法是进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合的 采用高Ca-高H法、PEG法和PEG-高 最佳方法。 表1融合方法对原生质体融合的影响 Tab.1 Effect of fusinm ethods on the pmotop hst fisin 融合方法fusion method 融合结果 高C-高H法 PEG法 PEG-高C-高H法 fuson results H gh Ca-high pH PEG PEG-H gh Ca-high pH 二源融合di eric fusion 42 10.5 17.8 多源融合polymeric fusin 1.1 44 56 注：以上融合时间为25 m n PEG浓度为3%。 Note The fus ion time is 25m n and the PEG concentratin is 30% 2.1.2PEG浓度对原生质体融合的影响 融合率成正相关，随着原生质体密度的增加，融 在进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合时， 合率也逐渐加大。当原生质体密度低于1.0×10 采用4种组合的PEG-6000浓度进行处理，处理 个mL时，融合率较低，而当密度为1.0×10个 时间为25mn然后在显微镜下观察，结果表明， mL以上时，尽管融合率很高，但多数为多源融 PEG浓度对原生质体融合率有着直接的影响。从 合体。综合考虑上述因素，原生质体融合的最佳 图1可见，随着PEG浓度的增大，原生质体融合 密度为5.0×10个mL。 率也逐渐提高。PEG浓度为30%时，二源融合率 ·多源融合 ▣二源融合 接近最高。而当PEG浓度为40%时，二源融合率 potymeric fusion dimeric fusion 3 达到最高此后，但同时多源融合率也急速增大。 25 此后，二源融合率开始降低，多源融合率继续增 2 加。从综合效果来看，30%PEG是甘蓝型油菜和 童 ⊙ 紫罗兰原生质体融合的最佳浓度。 0 10 50 1005001000 ■二源融合dimeric fusion 原生质体密度Density of protoplast/(万个·mL) 口多源触合polymeric fusion 25 图2原生质体的不同密度对融合率的影响 % Fig.2 Effect of different densities of 50 protoplast on frequency of fusion 注：以上融合方法为PEG结合高Ca-高pH法，PEG 5 浓度为30%，融合时间为25min。 0 Note:The fusion method was PEG-High Ca"-high pH 20 30 40 50 and the PEG concentration was thirty percent and the fusion PEG浓度% time is twenty-five minutes. 图1PEG浓度对源生质体融合的影响 2.1.4融合时间对原生质体融合的影响 Fig.I Effect of PEG concentrations on the protoplast fusion 提高PEG浓度和延长处理时间都可提高融合 注：以上融合方法为PEG结合高Ca-高pH法，融合时 率，但过高的浓度和过长的处理时间会导致融合 间为25min。 Note:The fusion method was PEG-High Ca-high pH 细胞活力下降。本试验分别处理15202530 and the fusion time was twenty-five minutes. mm其融合率（表2）随着处理时间的延长逐渐 2.1.3原生质体不同密度对融合率的影响 提高，但处理时间超过25mn后，聚集体总数增 来羚结果图2表明原焦质体的密度点pub1多俱源合比例没有增加，hn多源增多点
检并照相。 2 结果与分析 21 原生质体的融合 211 融合方法对原生质体融合的影响 采用高 C a 2+ - 高 pH 法、PEG法和 PEG - 高 C a 2+ - 高 pH 法 3 种不同的融合方法进行甘蓝型 油菜和紫罗兰原生质体融合, 其效果不同 (见表 1)。PEG- 高 Ca 2+ - 高 pH 法的总融合率最高, 且二源融合率也最高。因此, PEG - 高 C a 2 + - 高 pH 法是进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合的 最佳方法。 表 1 融合方法对原生质体融合的影响 Tab 1 Effect o f fusion m ethods on the protop last fusion 融合结果 fusion results 融合方法 fusion m ethod 高 C a 2+ -高 pH 法 H igh Ca 2+ - high pH PEG 法 PEG PEG- 高 C a 2+ - 高 pH 法 PEG- H igh C a 2+ - h igh pH 二源融合 d im eric fusion 4 2 105 17 8 多源融合 po lym eric fusion 1 1 4 4 5 6 注: 以上融合时间为 25m in, PEG浓度为 30% 。 No te: The fusion tim e is 25 m in and the PEG concentra tion is 30% . 212 PEG浓度对原生质体融合的影响 在进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合时, 采用 4种组合的 PEG - 6000浓度进行处理, 处理 时间为 25 m in, 然后在显微镜下观察, 结果表明, PEG 浓度对原生质体融合率有着直接的影响。从 图 1可见, 随着 PEG 浓度的增大, 原生质体融合 率也逐渐提高。 PEG浓度为 30% 时, 二源融合率 接近最高。而当 PEG 浓度为 40%时, 二源融合率 达到最高此后, 但同时多源融合率也急速增大。 此后, 二源融合率开始降低, 多源融合率继续增 加。从综合效果来看, 30% PEG 是甘蓝型油菜和 紫罗兰原生质体融合的最佳浓度。 213 原生质体不同密度对融合率的影响 实验结果 (图 2) 表明: 原生质体的密度与 融合率成正相关, 随着原生质体密度的增加, 融 合率也逐渐加大。当原生质体密度低于 10 10 5 个 /mL时, 融合率较低, 而当密度为 10 10 7 个 /mL以上时, 尽管融合率很高, 但多数为多源融 合体。综合考虑上述因素, 原生质体融合的最佳 密度为 50 10 5 个 /mL。 214 融合时间对原生质体融合的影响 提高 PEG 浓度和延长处理时间都可提高融合 率, 但过高的浓度和过长的处理时间会导致融合 细胞活力下降。本试验分别处理 15, 20, 25, 30 m in, 其融合率 (表 2) 随着处理时间的延长逐渐 提高, 但处理时间超过 25 m in后, 聚集体总数增 多, 但二源融合比例没有增加, 多源增多。当 第 3期 林良斌, 等: 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 297
298 云南农业大学学报 第23卷 PEG浓度为30%，处理时间为30min时，融合体 3d后细胞发生第1次分裂：两周左右形成小细胞 的分裂能力明显下降。 团。实验观察到，胞质较浓的融合体易于分裂， 表2融合液处理时间对融合率的影响 而胞质稀少的融合体仅能分裂两三次，然后死亡。 Tab.2 E ffect of duraton of fus ins soltion 2.2.2培养基对融合体培养的影响 tream ent on the frequency of fus ion 在均附加24-D1.5mgL,6BA0.5mg/L 融合液处理时间mn 融合率% NAA0.5mgL0.1mol/L葡萄糖和0.3mol/L蔗 duration of fuson soltin frequency of fsion 糖的情况下，运用液体浅层培养法，比较了改良 15 65 的KM8pB5和1/2MS培养基对融合体培养的影 20 11.5 响（表3）。从3表可知，在3种培养基中， 25 17.8 KM8p和B5培养基在第3d时发生第1次分裂， 30 22.4 但分裂频率相差很大，当培养15d后，KM8p培 注：以上融合方法为PEG结合高C-高山法， 养基培养的再生细胞团数多于B5培养基培养的 PBG浓度为30%。 Note The fusion m ethod w as PEG-H igh Ca-high pH 再生细胞团数，培养到35d时，只有KM8p培养 基可以培养出较多的直径约2m的愈伤组织。 and PEG concentration w as 30% 而12MS培养基从第1次分裂时间、分裂频率、 2.2融合体的培养 15d时再生细胞团数以及35d时形成的愈伤组织 2.21融合体培养及其早期分裂 数都不如上述两种培养基。故采用KM8即为基本 用改良的KM8p培养基进行液体浅层培养， 培养基为佳。 融合体在培养1d后，体积增大，有的呈椭圆形： 表3培养基对融合体的影响 Tah 3 Effect of basicmed ia on the hybreds of protoplasts 第1次分裂 培养7d时的 培养15d时 培养35d再生 培养基 时间/d 分裂频率% 再生细胞团数 愈伤组织数 media nitatin tme of division fiequency No.of cell cobnies No.of callus fm ation Ist division after 7 d n culure after 15 d n culure after 35 d in culture KM 8p 3 136 +++ +++ B5 3 9.8 ++ + 1/2MS 5 22 注：“+++”为很多，“++”为较多，“+”为较少，“-”为没有。表3相同。 Notc“+++”,“++”,“+”,“_”corespond ing stand for very may may few and nothing ad the same as table4 2.23不同激素浓度及组合对融合体培养的影响 融合体培养中应选择生长素和细胞分裂素一定比例 以改良KM8即为培养基培养融合体，培养密度 的组合，如仅用生长素或细胞分裂素则不利于细胞 为1.0×10个mL其中不同的激素组合和浓度对 分裂和愈伤组织形成。 融合体影响很大（表4）。从表4可知，1.5mgL 2.2.4不同密度对融合体培养的影响 24D,0.5 mg/L NAA和0.5 mL/L BA效果最好， 在融合体培养中，培养密度对原生质体的分 分裂频率高达13.8%。24-D对原生质体的分裂 裂频率影响很大（表5）。当培养密度过小时，原 频率影响较大，在无24D的培养基中，细胞分 生质体开始分裂的时间较长且分裂频率较低。当 裂的频率都很低，单独使用24D时分裂频率较 培养密度低至2.0×10个mL,不能形成愈伤组 高，且随着24D的浓度升高，细胞分裂频率增 织。随着融合体培养密度的增大，分裂频率逐渐 高，说明24D对融合体的分裂和愈伤组织的形 增高，但当培养密度过大时，容易导致细胞聚集、 成起着重要作用。使用24D与NAA、BA的组 粘连，影响细胞进一步分裂，最后导致褐化死亡。 合效果更好，不但分裂频率稍微提高，再生细胞团 本研究表明，培养密度为1.0×10个mL效果最 和再生愈伤组织快也有不酮程度的提高因此在pub1烁n分裂颍率祛品e植板率祛手%：v,.cnki.net
PEG 浓度为 30% , 处理时间为 30 m in时, 融合体 的分裂能力明显下降。 表 2 融合液处理时间对融合率的影响 Tab2 E ffect o f duration of fusions so lution treatm ent on the frequency of fusion 融合液处理时间 /m in duration o f fusion so lution 融合率 /% frequency o f fusion 15 6 5 20 115 25 178 30 224 注: 以上融合方法为 PEG 结合高 C a 2+ - 高 pH 法, PEG 浓度为 30% 。 No te: The fusion m ethod w as PEG- H igh Ca 2+ - high pH and PEG concentration w as 30% . 22 融合体的培养 221 融合体培养及其早期分裂 用改良的 KM 8p培养基进行液体浅层培养, 融合体在培养 1 d后, 体积增大, 有的呈椭圆形; 3 d后细胞发生第 1次分裂; 两周左右形成小细胞 团。实验观察到, 胞质较浓的融合体易于分裂, 而胞质稀少的融合体仅能分裂两三次, 然后死亡。 222 培养基对融合体培养的影响 在均附加 2, 4D 15 mg /L, 6BA 05 mg /L, NAA 05 mg /L, 01mo l/L葡萄糖和 03 mo l/L蔗 糖的情况下, 运用液体浅层培养法, 比较了改良 的 KM 8p, B5和 1 /2M S培养基对融合体培养的影 响 (表 3 )。从 3 表可 知, 在 3 种 培养 基中, KM 8p和 B5培养基在第 3 d 时发生第 1 次分裂, 但分裂频率相差很大, 当培养 15 d后, KM 8p培 养基培养的再生细胞团数多于 B5 培养基培养的 再生细胞团数, 培养到 35 d时, 只有 KM 8p培养 基可以培养出较多的直径约 2 mm 的愈伤组织。 而 1 /2M S 培养基从第 1次分裂时间、分裂频率、 15 d时再生细胞团数以及 35 d时形成的愈伤组织 数都不如上述两种培养基。故采用 KM 8p为基本 培养基为佳。 表 3 培养基对融合体的影响 Tab3 E ffec t of basicm ed ia on the hybreds o f protoplasts 培养基 media 第 1次分裂 时间 /d in itia tion tim e of 1st div ision 培养 7 d时的 分裂频率 /% d iv ision frequency after 7 d in cu lture 培养 15 d时 再生细胞团数 Noo f ce ll co lonies a fter 15 d in cu lture 培养 35 d再生 愈伤组织数 No of ca llus fo rm ation after 35 d in culture KM 8p 3 13 6 + + + + + + B5 3 9 8 + + + 1/2M S 5 2 2 + - 注: + + + ! 为很多, + + ! 为较多, + ! 为较少, - ! 为没有。表 3相同。 No te: + + + !, + + !, + !, - ! correspond ing stand for verym any, m any, few and nothing and the same as table 4. 223 不同激素浓度及组合对融合体培养的影响 以改良 KM 8p为培养基培养融合体, 培养密度 为 10 10 5 个 /mL, 其中不同的激素组合和浓度对 融合体影响很大 (表 4)。从表 4可知, 15mg /L 2, 4D, 05mg /L NAA和 05mL /L BA 效果最好, 分裂频率高达 138%。2, 4D对原生质体的分裂 频率影响较大, 在无 2, 4D 的培养基中, 细胞分 裂的频率都很低, 单独使用 2, 4D 时分裂频率较 高, 且随着 2, 4D的浓度升高, 细胞分裂频率增 高, 说明 2, 4D 对融合体的分裂和愈伤组织的形 成起着重要作用。使用 2, 4D 与 NAA、BA 的组 合效果更好, 不但分裂频率稍微提高, 再生细胞团 和再生愈伤组织块也有不同程度的提高。因此, 在 融合体培养中应选择生长素和细胞分裂素一定比例 的组合, 如仅用生长素或细胞分裂素则不利于细胞 分裂和愈伤组织形成。 224 不同密度对融合体培养的影响 在融合体培养中, 培养密度对原生质体的分 裂频率影响很大 (表 5)。当培养密度过小时, 原 生质体开始分裂的时间较长且分裂频率较低。当 培养密度低至 20 10 4 个 /mL, 不能形成愈伤组 织。随着融合体培养密度的增大, 分裂频率逐渐 增高, 但当培养密度过大时, 容易导致细胞聚集、 粘连, 影响细胞进一步分裂, 最后导致褐化死亡。 本研究表明, 培养密度为 10 10 5 个 /mL效果最 好, 分裂频率达 136% , 植板率达 58% 。 298 云南农业大学学报 第 23卷
第3期 林良斌，等：甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 299 表4激素对融合体培养的影响 Tab 4 Effect of phnt homone on he hybreds of protop hsts n culure 激素成分/(mgL') 再生细胞团数 再生愈伤组织数 分裂频率% hom one ompositon num ber of cells number of calluses 24-D 6-BA NAA KT division frequency oolon ies 1.5 1.0 0 0 105 ++ 1.5 05 0 0 11.4 ++ ++ 1.0 05 0 0 9.60 ++ 1.0 05 0 0.5 6.80 05 0 1.0 0 4.20 0 0 1.0 0.5 3.60 1.5 05 05 0 138 1.0 0 0 0 8.50 0 1.0 05 0 7.50 表5培养密度对融合体分裂的影响 Tab 5 Effect of different culture dens ties on the celld iv isin and colon ies fmation 培养密度/(×10.mL) 第一次分裂时间d 分裂频率% 植板率% 褐化情况 desity of cu luure tm e of first diisin division frequency plating effr iency brov ng 2 6 35 0.0 无nm J ￥ 9.6 3.5 无nam 10 3 13.6 5.8 无nam 20 3 16.5 3.7 较少lit上 50 3 17.4 2.0 明显obv ious 2.3杂种的细胞学鉴定 因素 对融合体再生的愈伤组织进行染色体观察， 本研究试用了高C-高H法、PEG法和 发现不同继代的愈伤组织的染色体条数不同，介 PEG结合高Ca+-高H法3种不同的融合方法。 于14~76条，而湘油15号的染色体条数为2n= 结果发现，高Ca-高H法的融合率最低，PEG 38紫罗兰的染色体条数为2n=14说明愈伤组 法次之，而PEG结合高Ca-高山法的融合率 织或是来源于同源融合，或是来源于异源融合， 最高。从目前成功的细胞融合的资料来看，绝大 或是来源于非融合体。在检测过的愈伤组织块中， 多数也都是以PEG与高Ca+-高H液相结合来 16.%的愈伤组织块染色体数目在38~52条之 诱导原生质体融合为主，这说明了此项技术的可 间，可见它来源于异源融合体，而且同一块愈伤 行性与适应性。但在应用此法时，PEG的分子 组织中细胞的染色体数目也并不尽同，可能是融 量、浓度、纯度、Ca+的浓度以及H等都会影 合体在分裂过程中紫罗兰染色体逐步被排斥所造 响融合体的“质”和“量”9。另外，PEG诱导 成的。选取染色体数目在38~52条之间的愈伤组 植物原生质体聚集和融合的机理目前尚不清楚， 织块进行扩增及植株再生，得到了再生植株。对 在这种情况下，只有进行实验设计和大量重复实 再生植株其进行细胞学检测，发现有绝大多数植 验才有可能找到合适的融合条件。 株的染色体数为38条，说明紫罗兰的染色体在融 原生质体的浓度对融合效果主要表现在二源 合体中逐渐被排斥掉。 融合与多源融合的比例以及融合体的活力等方面。 本研究表明。随着原生质体的浓度增大，原生质 3讨论 体易于聚集、粘连，融合率逐渐增高，但同时多 3,J影响其落型油莱和紫罗兰原生质体融盒的ub源融合也提商并目些逐渐多干源融合森
表 4 激素对融合体培养的影响 Tab4 Effect of p lant ho rmone on the hybreds o f pro top lasts in cu lture 激素成分 / ( m g∃ L - 1 ) horm one composition 分裂频率 /% d iv ision frequency 再生细胞团数 num ber of ce lls 再生愈伤组织数 number of ca lluses 2, 4- D 6- BA NAA KT co lon ies 1 5 1 0 0 0 105 + + + 1 5 0 5 0 0 114 + + + + 1 0 0 5 0 0 960 + + + 1 0 0 5 0 05 680 + + 0 5 0 1 0 0 420 + - 0 0 1 0 05 360 - - 1 5 0 5 0 5 0 138 + + + + + + 1 0 0 0 0 850 + + 0 1 0 0 5 0 750 - - 表 5 培养密度对融合体分裂的影响 Tab 5 E ffect o f different culture densities on the cell d iv ision and co lon ies fo rm ation 培养密度 / ( 10 4 ∃ mL - 1 ) density o f cu lture 第一次分裂时间 /d tim e o f first d iv ision 分裂频率 /% division frequency 植板率 /% plating effic iency 褐化情况 brow ing 2 6 3 5 00 无 non 5 4 9 6 35 无 non 10 3 136 58 无 non 20 3 165 37 较少 little 50 3 174 20 明显 obv ious 23 杂种的细胞学鉴定 对融合体再生的愈伤组织进行染色体观察, 发现不同继代的愈伤组织的染色体条数不同, 介 于 14~ 76条, 而湘油 15号的染色体条数为 2n= 38, 紫罗兰的染色体条数为 2n= 14, 说明愈伤组 织或是来源于同源融合, 或是来源于异源融合, 或是来源于非融合体。在检测过的愈伤组织块中, 167%的愈伤组织块染色体数目在 38 ~ 52 条之 间, 可见它来源于异源融合体, 而且同一块愈伤 组织中细胞的染色体数目也并不尽同, 可能是融 合体在分裂过程中紫罗兰染色体逐步被排斥所造 成的。选取染色体数目在 38~ 52条之间的愈伤组 织块进行扩增及植株再生, 得到了再生植株。对 再生植株其进行细胞学检测, 发现有绝大多数植 株的染色体数为 38条, 说明紫罗兰的染色体在融 合体中逐渐被排斥掉。 3 讨论 31 影响甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合的 因素 本研究试用了高 C a 2+ - 高 pH 法、 PEG 法和 PEG结合高 Ca 2+ - 高 pH 法 3种不同的融合方法。 结果发现, 高 C a 2+ - 高 pH 法的融合率最低, PEG 法次之, 而 PEG结合高 Ca 2+ - 高 pH 法的融合率 最高。从目前成功的细胞融合的资料来看, 绝大 多数也都是以 PEG 与高 Ca 2+ - 高 pH 液相结合来 诱导原生质体融合为主, 这说明了此项技术的可 行性与适应性。但在应用此法时, PEG 的分子 量、浓度、纯度、 Ca 2+ 的浓度以及 pH 等都会影 响融合体的 质 ! 和 量! [ 9]。另外, PEG 诱导 植物原生质体聚集和融合的机理目前尚不清楚, 在这种情况下, 只有进行实验设计和大量重复实 验才有可能找到合适的融合条件。 原生质体的浓度对融合效果主要表现在二源 融合与多源融合的比例以及融合体的活力等方面。 本研究表明, 随着原生质体的浓度增大, 原生质 体易于聚集、粘连, 融合率逐渐增高, 但同时多 源融合率也提高, 并且比例逐渐多于二源融合率。 第 3期 林良斌, 等: 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 299