7-3核酸的物理化学性质上册P502 (一)核酸的水解: 所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解 (1)酸水解 糖苷键比磷酸二酯键易被水解,嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解 (2)碱水解 磷酸酯键易水解,RNA比DNA易水解,因为RNA核糖上有2-OH,水解过 程见P502。 (3)酶水解 为水解磷酸二酯键的酶,专一水解核酸的为核酸酶。 核酸酶的分类 按底物专一性分为RNasε(核糖核酸酶)和 DNase(脱氧核糖核酸酶)。 按对底物作用方式分为内切酶(作用点在核糖核酸酶内部)和外切酶(作用 点在末端)。 2. RNase:如牛胰核糖核酸酶(EC2.7.7.16),内切酶,作用位点为嘧啶核苷(Py) 3-磷酸与其他核苷酸之间的连键。 3.限制性内切酶:为 DNase 剪裁DNA的工具,可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现,目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基 化酶成对存在,自身酶作用位点的碱基被甲基化,内切酶不再降解,因而可 识别和降解外源DNA。 断裂位点处常有二重旋转(轴)对称性(回文结构,正读反读相同),在特定 位点两条链切断后形成粘末端或平末端 限制性内切酶命名:如E.coRI,第1个字母E(大写),为大肠杆菌(E.coli) 属名的第一个字母,第2、3两个字母co(小写)为种名头两个字母,第4 个字母R,表示菌株,最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。 (二)核酸的酸碱性质: 核苷和核苷酸都是兼性离子,碱基和磷酸基均能解离,见P505,具有酸碱性 由于DNA酸碱变性,使酸碱滴定曲线不可逆 (三)核酸的紫外吸收: 嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键,核苷和核酸的吸收波段在240~290m,最大吸 攸值在260nm附近(蛋白质最大吸收值280nm)。 (1)可用于测样品纯度(测吸光度A): A260/A280比值,纯DNA应大于1.8,纯RNA应达到20,若样品混有杂 蛋白,比值明显降低 对于纯样品,从260m的A值即可算出含量。A值为1,相当于50μg/mL DNA双螺旋,或40μgmL单链DNA(或RNA,或20ug/mL寡核苷酸 (2)核酸的摩尔磷吸光系数ε(P):为含有1克原子磷(30.98g)的核酸在260nm 处的吸光系数 e(P)=A/CL.=30.98A/WL A:吸收值,C:每升溶液的磷摩尔数,C=W/30.98,L:比色杯内径。 一般天然DNAE(P)为6600,RNA为7700~7800 由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠,使紫外吸收比单链减少, 由此可判断DNA是否变性
7-3 核酸的物理化学性质 上册 P502 （一） 核酸的水解： 所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。 （1） 酸水解： 糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。 （2） 碱水解： 磷酸酯键易水解，RNA 比 DNA 易水解，因为 RNA 核糖上有 2 ‘ -OH，水解过 程见 P502。 （3） 酶水解： 为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。 1. 核酸酶的分类： 按底物专一性分为 RNase（核糖核酸酶）和 DNase（脱氧核糖核酸酶）。 按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用 点在末端）。 2. RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py） -3 ‘ -磷酸与其他核苷酸之间的连键。 3. 限制性内切酶：为 DNase。 剪裁 DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶往往与甲基 化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可 识别和降解外源 DNA。 断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定 位点两条链切断后形成粘末端或平末端。 限制性内切酶命名：如 E. coR Ⅰ，第 1 个字母 E(大写)，为大肠杆菌(E.coli) 属名的第一个字母，第 2、3 两个字母 co（小写）为种名头两个字母，第 4 个字母 R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。 （二） 核酸的酸碱性质： 核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见 P505，具有酸碱性。 由于 DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。 （三） 核酸的紫外吸收： 嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在 240~290nm，最大吸 收值在 260nm 附近（蛋白质最大吸收值 280nm）。 （1） 可用于测样品纯度（测吸光度 A）： A260/A280 比值，纯 DNA 应大于 1.8，纯 RNA 应达到 2.0，若样品混有杂 蛋白，比值明显降低。 对于纯样品，从 260nm 的 A 值即可算出含量。A 值为 1，相当于 50μg/mL DNA 双螺旋，或 40μg/mL 单链 DNA（或 RNA），或 20μg/mL 寡核苷酸。 （2） 核酸的摩尔磷吸光系数ε（P）：为含有 1 克原子磷（30.98g）的核酸在 260nm 处的吸光系数。 ε（P）= A / CL. = 30.98 A / W L A：吸收值， C：每升溶液的磷摩尔数，C=W/30.98， L：比色杯内径。 一般天然 DNA ε（P）为 6600，RNA 为 7700~7800 由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，使紫外吸收比单链减少， 由此可判断 DNA 是否变性
DNA变性时ε(P)值升高,增色效应。 DNA复性时ε(P)值降低,减色效应。 核酸比所含核苷酸单体的ε(P)低40~45% (四)核酸的变性、复性及杂交 (1)变性:核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链,不涉及共价键的断裂 降解:多核苷酸骨架上共价键(3,5-磷酸二酯键)断裂,分子量降低。 引起变性因素:热变性,酸碱变性,变性剂(如尿素,甲醛等)变性(竞争形 成氢键) DNA变性温度:又称熔点或熔解温度,为DNA双螺旋结构失去一半时的 温度,用Tm表示,DNA的Tm一般为82~95。DNA变性是爆发式的,变性 在一个很窄温度范围内发生 P508图144为DNA变性过程。 影响Tm的因素: 1.DNA的均一性:均一则Tm窄,如poly(A-T), poly d(G-C)等,Tm窄。 2.G-C含量:Tm值与G-C含量成正比,G-C含量越高,Tm值越高,因为 G-C间三个氢键。 G-C含量与Tm关系的经验公式 G-C%=(Tm-693)×2.44 可由G-C含量计算Tm或由Tm计算G-C含量 3.介质离子强度 离子强度较高时,DNA的Tm值较高,DNA较稳定,因此DNA的保存在 含盐(如1 mol NaCl)缓冲溶液中 RNA的变性:RNA分子中有局部双螺旋区,所以也可发生变性,只是Tm值 较低,且范围较宽 双链RNA变性几乎与DNA同。 (2)复性:变性DNA在适当条件下,两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的 过程称为复性 变性DNA在缓慢冷却时,可以复性的过程称为退火。加热变性的DNA为 防止复性,需骤冷处理。 DNA复性,浓度越大复性越快,且具有多重复序列的复性快。 (3)核酸的杂交:不同来源的DNA热变性后慢慢冷却,若异源DNA之间某些区域 有相同序列,则复性时会形成杂交DNA分子。 DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。 核酸杂交应用广泛,可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的DNA片 断,将少量基因钓出,是基因芯片,基因探针的工作根据
DNA 变性时ε（P）值升高，增色效应。 DNA 复性时ε（P）值降低，减色效应。 核酸比所含核苷酸单体的ε（P）低 40~45%。 （四） 核酸的变性、复性及杂交： （1） 变性：核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链，不涉及共价键的断裂。 降解：多核苷酸骨架上共价键（3 ‘，5 ‘ -磷酸二酯键）断裂，分子量降低。 引起变性因素：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素，甲醛等）变性（竞争形 成氢键）。 DNA 变性温度：又称熔点或熔解温度，为 DNA 双螺旋结构失去一半时的 温度，用 Tm表示，DNA 的 Tm一般为 82~950C。DNA 变性是爆发式的，变性 在一个很窄温度范围内发生。 P508 图 14-4 为 DNA 变性过程。 影响 Tm的因素： 1. DNA 的均一性：均一则 Tm窄，如 poly (A-T)， poly d(G-C)等， Tm窄。 2. G-C 含量：Tm 值与 G-C 含量成正比，G-C 含量越高，Tm 值越高，因为 G-C 间三个氢键。 G-C 含量与 Tm关系的经验公式： G-C% = (Tm - 69.3) ×2.44 可由 G-C 含量计算 Tm或由 Tm计算 G-C 含量。 3. 介质离子强度： 离子强度较高时，DNA 的 Tm值较高，DNA 较稳定，因此 DNA 的保存在 含盐（如 1mol NaCl）缓冲溶液中。 RNA 的变性：RNA 分子中有局部双螺旋区，所以也可发生变性，只是 Tm值 较低，且范围较宽 双链 RNA 变性几乎与 DNA 同。 （2） 复性：变性 DNA 在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的 过程称为复性。 变性 DNA 在缓慢冷却时，可以复性的过程称为退火。加热变性的 DNA 为 防止复性，需骤冷处理。 DNA 复性，浓度越大复性越快，且具有多重复序列的复性快。 （3） 核酸的杂交：不同来源的 DNA 热变性后慢慢冷却，若异源 DNA 之间某些区域 有相同序列，则复性时会形成杂交 DNA 分子。 DNA 与互补的 RNA 之间也可发生杂交。 核酸杂交应用广泛，可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的 DNA 片 断，将少量基因钓出，是基因芯片，基因探针的工作根据