稀释涂布平板法的基本步骤如下: (1)制备固体培养基 (2)编号 取6支无菌空试管,依次编号为10、102、103、10、10°、10°,将固体培养基平板 分别编号为10、10°、10°,每个稀释度各三个平板。 (3)稀释 取上述已繁殖好的细菌培养液l毗,用p=2.5的稀硫酸溶液按每次稀释10倍,依次 稀释成10、102、103、10、105、10°浓度的稀释液 4)取样 吸取稀释度10、10°、10°的稀释液各0.2皿,然后分别接种到编好号的平板上,涂布 均匀 (5)培养 将涂布后的平板倒置于30℃的恒温培养箱中培养,直至平板表面出现铁锈色圆点状小 菌落 (6)选取单菌落 将单独小菌落挑起,每个小菌落分别接种于液体培养基中培养。这样培养岀的细菌即为 单一菌的纯培养 2平板划线分离法 平板划线分离法是用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种 方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。 其基本步骤如下: (1)制备固体培养基 (2)划线 将烧红的接种环冷却后,挑取原菌液划线,划线时动作要轻巧,线条要平行且密集,要 充分利用平板培养基的表面积。平板划分时划为四个作用不同的A、B、C、D区(见图2-4) D区是单菌落的主要分布区。 (3)培养 将培养皿置于30℃恒温箱中培养,直至培养基上岀现小的铁锈色圆状小菌落。 (4)挑选单菌落 将D区或C区出现的典型单菌落移接至液体培养基中培养
11 稀释涂布平板法的基本步骤如下： （1）制备固体培养基 （2）编号 取 6 支无菌空试管，依次编号为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，将固体培养基平板 分别编号为 10-4、10-5、10-6，每个稀释度各三个平板。 （3）稀释 取上述已繁殖好的细菌培养液 1mL，用 pH = 2.5 的稀硫酸溶液按每次稀释 10 倍，依次 稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度的稀释液。 （4）取样 吸取稀释度 10-4、10-5、10-6 的稀释液各 0.2mL，然后分别接种到编好号的平板上，涂布 均匀。 （5）培养 将涂布后的平板倒置于 30℃的恒温培养箱中培养，直至平板表面出现铁锈色圆点状小 菌落。 （6）选取单菌落 将单独小菌落挑起，每个小菌落分别接种于液体培养基中培养。这样培养出的细菌即为 单一菌的纯培养。 2 平板划线分离法[14] 平板划线分离法是用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种 方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。 其基本步骤如下： （1）制备固体培养基 （2）划线 将烧红的接种环冷却后，挑取原菌液划线，划线时动作要轻巧，线条要平行且密集，要 充分利用平板培养基的表面积。平板划分时划为四个作用不同的 A、B、C、D 区（见图 2-4）， D 区是单菌落的主要分布区。 （3）培养 将培养皿置于 30℃恒温箱中培养，直至培养基上出现小的铁锈色圆状小菌落。 （4）挑选单菌落 将 D 区或 C 区出现的典型单菌落移接至液体培养基中培养
动 图2-4操做示意及平板分区图 3终点稀释法 取繁殖好的菌样l皿L,注入盛有液体培养基9mL的试管中,混合均匀,然后再从此试管 中吸取1mL注入另一盛有培养基L的试管中,依次类推制成10、102、103…100不同稀 释度的培养液。将10支试管均放入恒温培养箱中培养τ~8d后取出。由于各管中原始菌浓度 不同,培养基颜色变化不一,颜色深浅与原始菌浓度成正比。若第7支试管变色而第δ支不 变色,则认为第7支试管极有可能含单一菌的纯培养 这种方法简便,但有可能分离出的纯培养并不是所希望的菌种 4纯培养的检验 为检验所获菌种的纯度,可将上述获得的纯培养接种到适合于杂菌生长的固体培养基 上,如牛肉汤培养基、 Waksman培养基等。观察是否有菌生长,如无,表明所获菌株是纯的 如有,则表明所获菌株是不纯的,需再次分离。 2.2.4菌种的保藏 优良的活性菌种应及时进行保藏。菌种的保藏要达到不死亡和不变异两个要求。因此, 必须使微生物的代谢作用相对地处于最不活跃的状态。若为短期保存,则可将充分生长的 T.f菌停止培养,在菌液中加入少许FeS0·7H20后,移入4℃的冰箱中保存,每月尚需转种 一次。长期菌种保藏方法很多,如:斜面低湿保藏法、液体石蜡保藏法、砂土-一黄铁矿保 藏法及冰冻干燥法。但对于浸矿菌种而言,后两种方法较为有效 1砂土一一黄铁矿保藏法 将T.f菌培养液转移到无菌试管或安瓿管中。瓶中预先装有砂土与黄铁矿1:3的混 合物。砂土、黄铁矿均经过筛砂、清洗、干燥、灭菌。取每1~2皿菌浓度为10°个/的细 菌培养液混入砂土——一黄铁矿混合物Σ~3g,将试管塞紧蜡封或将安瓿管熔封,室温保藏。 此法可保藏菌种2.5~3年
12 图 2-4 操做示意及平板分区图 3 终点稀释法 取繁殖好的菌样 1mL，注入盛有液体培养基 9mL 的试管中，混合均匀，然后再从此试管 中吸取 1mL 注入另一盛有培养基 9mL 的试管中，依次类推制成 10-1、10-2、10-3…10-10 不同稀 释度的培养液。将 10 支试管均放入恒温培养箱中培养 7~8d 后取出。由于各管中原始菌浓度 不同，培养基颜色变化不一，颜色深浅与原始菌浓度成正比。若第 7 支试管变色而第 8 支不 变色，则认为第 7 支试管极有可能含单一菌的纯培养。 这种方法简便，但有可能分离出的纯培养并不是所希望的菌种。 4 纯培养的检验 为检验所获菌种的纯度，可将上述获得的纯培养接种到适合于杂菌生长的固体培养基 上，如牛肉汤培养基、Waksman 培养基等。观察是否有菌生长，如无，表明所获菌株是纯的； 如有，则表明所获菌株是不纯的，需再次分离。 2.2.4 菌种的保藏 优良的活性菌种应及时进行保藏。菌种的保藏要达到不死亡和不变异两个要求。因此， 必须使微生物的代谢作用相对地处于最不活跃的状态。若为短期保存，则可将充分生长的 T．f 菌停止培养，在菌液中加入少许 FeSO4•7H2O 后，移入 4℃的冰箱中保存，每月尚需转种 一次。长期菌种保藏方法很多，如：斜面低湿保藏法、液体石蜡保藏法、砂土—－黄铁矿保 藏法及冰冻干燥法。但对于浸矿菌种而言，后两种方法较为有效。 1 砂土—－黄铁矿保藏法 将 T．f 菌培养液转移到无菌试管或安瓿管中。瓶中预先装有砂土与黄铁矿 1∶3 的混 合物。砂土、黄铁矿均经过筛砂、清洗、干燥、灭菌。取每 1～2mL 菌浓度为 109 个/mL 的细 菌培养液混入砂土——黄铁矿混合物 2～3g，将试管塞紧蜡封或将安瓿管熔封，室温保藏。 此法可保藏菌种 2.5～3 年
2冰冻干燥法 将菌体培养物离心,制得菌种悬浮液。用蒸馏水快速漂洗,直至p达到7左右,然后 转移到安瓿管中,并加入细胞保护剂,将安瓿管置于-70℃的低温冰箱中冰冻24h,再冰冻 干燥24h后封口。制备好的安瓿管放置在低温避光处保藏 5.3浸矿细菌计数及细菌生长曲线 微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况 就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标。所以有必要对微生物的生长繁殖及 其控制规律作介绍。 5.3.1测生长量 生长意味着原生质量的增加,所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据,而测 定繁殖则都要建立在计数这一基础上。 1宜接法 (1)测体积 这是一种很粗放的方法,用于初步比较用。将一定体积的待测培养液放在刻度离心管中 自然沉降或进行定时间的离心,然后观察其体积 (2)称干重 可用离心法或过滤法测定,一般干重为湿重的10%~20%。在离心法中,将待测培养液 放入离心管中,用清水离心洗涤1~5次后,进行干燥。干燥温度可采用105℃、100℃或红 外线烘干,也可在较低的温度(80℃或40℃)下进行真空干燥,然后称干重。以细菌为例, 个细胞一般重约102~10-g 2间接法 (1)比浊法 细菌培养物在其生长过程中,由于原生质含量的增加,会引起培养物浑浊度的增高。使 用光电比色计测菌液的透光度,或自行制作的比浊管进行测定。 (2)测含氮量 蛋白质是细胞的重要物质,含量一般比较稳定,而氮又是蛋白质的重要组分。细菌的含 氮量约为原生质干重的12.5%。根据其含量再乘以6.25,即可测得其粗蛋白的含量。测定含 氮量的方法很多,如用硫酸、过氯酸、碘酸或磷酸等消化法和 Dumas测氮气法。 (3)DNA含量测定 DNA与20%的3,5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液能显示特殊的荧光。根据这一原理测出DNA
13 2 冰冻干燥法 将菌体培养物离心，制得菌种悬浮液。用蒸馏水快速漂洗，直至 pH 达到 7 左右，然后 转移到安瓿管中，并加入细胞保护剂，将安瓿管置于-70℃的低温冰箱中冰冻 24h，再冰冻 干燥 24h 后封口。制备好的安瓿管放置在低温避光处保藏。 5.3 浸矿细菌计数及细菌生长曲线[15] 微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况 就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标。所以有必要对微生物的生长繁殖及 其控制规律作介绍。 5.3.1 测生长量 生长意味着原生质量的增加，所以测定生长的方法也都直接或间接地以此为根据，而测 定繁殖则都要建立在计数这一基础上。 1 直接法 （1）测体积 这是一种很粗放的方法，用于初步比较用。将一定体积的待测培养液放在刻度离心管中 自然沉降或进行定时间的离心，然后观察其体积。 （2）称干重 可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的 10%～20%。在离心法中，将待测培养液 放入离心管中，用清水离心洗涤 1～5 次后，进行干燥。干燥温度可采用 105℃、100℃或红 外线烘干，也可在较低的温度（80℃或 40℃）下进行真空干燥，然后称干重。以细菌为例， 一个细胞一般重约 10-12～10-13 g。 2 间接法 （1）比浊法 细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物浑浊度的增高。使 用光电比色计测菌液的透光度，或自行制作的比浊管进行测定。 （2）测含氮量 蛋白质是细胞的重要物质，含量一般比较稳定，而氮又是蛋白质的重要组分。细菌的含 氮量约为原生质干重的 12.5%。根据其含量再乘以 6.25，即可测得其粗蛋白的含量。测定含 氮量的方法很多，如用硫酸、过氯酸、碘酸或磷酸等消化法和 Dumas 测氮气法。 （3）DNA 含量测定 DNA 与 20 %的 3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液能显示特殊的荧光。根据这一原理测出 DNA
的含量,即可推算出细菌的总量。每个细菌平均含DNA8.4×10g 5.4.2测细胞数 1直接法 是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。所测结果是包括死细胞在内的总细菌 (1)比例计数法 这是一种很粗的计数方法。将已知颗粒浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均 匀混合,在显微镜视野中数出各自的数目,然后求出未知菌液中的细胞浓度。 (2)血球计数板法 这是用来测定一定容积中的细胞总数的常规方法,也是浸矿细菌计数的一种方法。血球 计数板法测定的原理是:将经一定稀释的菌体悬液注入血球计数板的计数室,然后在显微镜 下逐格计数。血球计数板是一块特制的载玻片,其上由四条平行槽构成三个平台,中间的平 台较宽,此平台又被一短槽隔成两半,每边平台上面各刻有一个方格网,每个方格网共分九 大格,中央大格即为计数板的计数室(见图2-5)。计数室的边长为1毫米,中间平台下陷 0.1毫米,故盖上盖玻片后计数室的容积为0.1立方毫米。所以可根据在显微镜下观察到的 微生物数目换算成单位体积中微生物的含量 在测定细菌数目之前应将血球计数板擦洗干净,再将盖玻片安放在计数室上面,然后用 接种环取一环均匀的菌体悬液,使它沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室,连续二至三次 直至注满计数室为止,后置于显微镜载物台的中央计数。由于浸矿细菌小、无色透明,且 9K、 leather培养基在培养过程中产生氢氧化铁或黄钾铁矾沉淀,干扰测定。为解决上述问 题可在计数之前先将待测细菌用草酸铵结晶紫染色間
14 的含量，即可推算出细菌的总量。每个细菌平均含 DNA 8.4×10-14 g。 5.4.2 测细胞数 1 直接法 是指在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法。所测结果是包括死细胞在内的总细菌 数。 （1）比例计数法 这是一种很粗的计数方法。将已知颗粒浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均 匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。 （2）血球计数板法 这是用来测定一定容积中的细胞总数的常规方法，也是浸矿细菌计数的一种方法。血球 计数板法测定的原理是：将经一定稀释的菌体悬液注入血球计数板的计数室，然后在显微镜 下逐格计数。血球计数板是一块特制的载玻片，其上由四条平行槽构成三个平台，中间的平 台较宽，此平台又被一短槽隔成两半，每边平台上面各刻有一个方格网，每个方格网共分九 大格，中央大格即为计数板的计数室（见图 2-5）。计数室的边长为 1 毫米，中间平台下陷 0.1 毫米，故盖上盖玻片后计数室的容积为 0.1 立方毫米。所以可根据在显微镜下观察到的 微生物数目换算成单位体积中微生物的含量。 在测定细菌数目之前应将血球计数板擦洗干净，再将盖玻片安放在计数室上面，然后用 接种环取一环均匀的菌体悬液，使它沿着盖玻片与计数板的缝隙渗入计数室，连续二至三次， 直至注满计数室为止，后置于显微镜载物台的中央计数。由于浸矿细菌小、无色透明，且 9K、leathen 培养基在培养过程中产生氢氧化铁或黄钾铁矾沉淀，干扰测定。为解决上述问 题可在计数之前先将待测细菌用草酸铵结晶紫染色[16]
0.10m|#|xB-K-25 图 血球计数板的构造 顶面观B:侧面观C:九大格D:一大格(25中格) 1:中央平台2:盖玻片 2间接法 间接法是一种活细菌计数法,是根据活细胞通过生长繁殖会使液体培养基浑浊或在平板 培养表面形成菌落的原理而设计的方法 (1)液体释稀法 对待测菌样作连续的10倍系列释稀。根据估计数,从最适宜的3个连续的10倍的释稀 液中各取5ml试样,接种到3组共15支装有培养液的试管中(每管接入1m)。经培养后, 记录每个稀释度出现生长的试管,然后査最大可能数量表,再根据样品的稀释倍数计算出其 中的活菌含量。 (2)平板菌落计数法 这是一种最常见的活菌计数法。取一定体积的释稀菌液与合适的固体培养基在其凝固前 均匀混合,或涂布于已凝固的固体培养基平板上。经保温培养后,以平板上(内)出现的菌落 数乘上菌液的稀释度,即可计算出原菌液的含菌数。在一个9cm直径的培养皿平板上,一般 以出现50~500个菌落为宜 以上介绍了若干测定微生物生长量和细胞数目的方法。不管什么方法,都有其缺点和使 用范围,所以在使用前,一定要据据自己的研究对象和研究目的选择最合适的方法。 5.4.3浸矿徽生物的生长曲线
15 图 2-5 血球计数板的构造 A：顶面观 B：侧面观 C： 九大格 D：一大格（25 中格） 1： 中央平台 2：盖玻片 2 间接法 间接法是一种活细菌计数法，是根据活细胞通过生长繁殖会使液体培养基浑浊或在平板 培养表面形成菌落的原理而设计的方法。 （1）液体释稀法 对待测菌样作连续的 10 倍系列释稀。根据估计数，从最适宜的 3 个连续的 10 倍的释稀 液中各取 5ml 试样，接种到 3 组共 15 支装有培养液的试管中（每管接入 1mL）。经培养后， 记录每个稀释度出现生长的试管，然后查最大可能数量表，再根据样品的稀释倍数计算出其 中的活菌含量。 （2）平板菌落计数法 这是一种最常见的活菌计数法。取一定体积的释稀菌液与合适的固体培养基在其凝固前 均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。经保温培养后，以平板上(内)出现的菌落 数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。在一个 9cm 直径的培养皿平板上，一般 以出现 50~500 个菌落为宜。 以上介绍了若干测定微生物生长量和细胞数目的方法。不管什么方法，都有其缺点和使 用范围，所以在使用前，一定要据据自己的研究对象和研究目的选择最合适的方法。 5.4.3 浸矿微生物的生长曲线