当我们把少量纯种微生物接种到恒容积的液体培养基中后,在适宜的温度、通气等条件 下,它们的群体就会有规律地生长起来。如以细胞数目对数值作纵坐标,以培养时间作横坐 标,就可以画出一条有规律的曲线,这就是微生物的生长曲线( growth curve,见图2-6) 根据微生物的生长速度常数( growth rate constant),即每小时的分裂代数(R)的不同 一般可把生长曲线分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期。细菌的生长曲线对掌 握细菌生长规律很重要。通过生长曲线可以知道细菌在哪个时期年轻且代谢活跃,哪个时期 衰老而濒于死亡,这样可根据需要在不同时期收集菌种。如需快速氧化Fe2,则应收集对数 期的浸矿细菌,若保存菌种,则最好取稳定期的菌种。 (-) 总菌数 E←献需等 活菌数 II III 培养时间(h) 图2-6典型生长曲线 Ⅰ:延滞期Ⅱ:指数期Ⅲ1:稳定期Ⅳ:衰亡期 1延滞期(1 ag phase) 又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养液中后,在开始培养的一般 时间内细胞数目不增加的时期。该时期的细胞有以下几个特点 (1)生长速度常数等于零 (2)细胞形态变大或增大 (3)细胞RNA尤其是rRNA含量增高,原生质呈嗜碱性 (4)合成代谢活跃、核糖体、酶类和ATP的合成加快,易产生诱导酶; (5)对外界不良条件反应敏感。 影响延滞期长短的因素除细胞本身的生理特性外,还有接种龄、按种量、培养基成分等。 延滞期太长不利于工业生产,因此应尽量设法缩短延滞期。常用的措施有增加接种量,采用
16 当我们把少量纯种微生物接种到恒容积的液体培养基中后，在适宜的温度、通气等条件 下，它们的群体就会有规律地生长起来。如以细胞数目对数值作纵坐标，以培养时间作横坐 标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的生长曲线（growth curve，见图 2-6）。 根据微生物的生长速度常数(growth rate constant)，即每小时的分裂代数（R）的不同， 一般可把生长曲线分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期。细菌的生长曲线对掌 握细菌生长规律很重要。通过生长曲线可以知道细菌在哪个时期年轻且代谢活跃，哪个时期 衰老而濒于死亡，这样可根据需要在不同时期收集菌种。如需快速氧化 Fe 2+，则应收集对数 期的浸矿细菌，若保存菌种，则最好取稳定期的菌种。 图 2-6 典型生长曲线 Ⅰ： 延滞期 Ⅱ： 指数期 Ⅲ： 稳定期 Ⅳ：衰亡期 1 延滞期(lag phase) 又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一般 时间内细胞数目不增加的时期。该时期的细胞有以下几个特点： （1）生长速度常数等于零； （2）细胞形态变大或增大； （3）细胞 RNA 尤其是 rRNA 含量增高，原生质呈嗜碱性； （4）合成代谢活跃、核糖体、酶类和 ATP 的合成加快，易产生诱导酶； （5）对外界不良条件反应敏感。 影响延滞期长短的因素除细胞本身的生理特性外，还有接种龄、按种量、培养基成分等。 延滞期太长不利于工业生产，因此应尽量设法缩短延滞期。常用的措施有增加接种量，采用
最适菌龄(即处于对数期的细菌)等。 2指数期( exponential phase) 又称为对数期,是指在生长曲线中,紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的 段时期,见图2-7。指数期的细菌有以下几个特点 (1)生长速度常数R最大; (2)细胞进行平衡生长,菌体内各种成分最为均匀 (3)酶系活跃,代谢旺盛。 在指数期中,有三个参数最为重要。 (1)繁殖代数(n),从图2-7可以看出, x 以对数表示 lgx,=lgx,+n/g2 Ka- n3=3.32gx2-gx1) (2)生长速率常数(R) R=n=33221gx2-gx) 培养时间(h) (3)代时(G G=R=3221x- 图2-7指数期生长曲线 指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致,细胞成分平衡发展和生长速度恒定, 故可作为代谢、生理等研究的良好材料。 3稳定期( stationary phase) 又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速度常数R等于0,即处于新繁殖的细胞数与 衰亡的细胞数相等或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 稳定期到来的主要原因是: (1)营养物尤其是生长限制因子的耗尽 (2)营养物的比例失调,例如C/N比例不合适等;
17 细胞个数（个 ） x1 x2 培养时间（ ） t1 t2 最适菌龄（即处于对数期的细菌）等。 2 指数期（exponential phase） 又称为对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一 段时期，见图 2-7。指数期的细菌有以下几个特点： （1）生长速度常数 R 最大； （2）细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀； （3）酶系活跃，代谢旺盛。 在指数期中，有三个参数最为重要。 （1）繁殖代数（n），从 图 2-7 可以看出， n x2 = x1 2 以对数表示 lgx2 = lgx1 + nlg2 3.322(lgx lgx ) lg2 lgx lgx n 2 1 2 1 = − − = （2）生长速率常数（R） 2 1 2 1 2 1 t t 3.322(lgx lgx ) t t n R − − = − = （3）代时（G） 3.322(lgx lgx ) t t R 1 G 2 1 2 1 − − = = 图 2-7 指数期生长曲线 指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致，细胞成分平衡发展和生长速度恒定， 故可作为代谢、生理等研究的良好材料。 3 稳定期（stationary phase） 又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速度常数 R 等于 0，即处于新繁殖的细胞数与 衰亡的细胞数相等或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 稳定期到来的主要原因是： （1）营养物尤其是生长限制因子的耗尽； （2）营养物的比例失调，例如 C/N 比例不合适等；
(3)酸、醇、毒素等有害代谢产物的积累; (4)p值、氧化还原势等物化条件越来越不适宜等等 4衰亡期 在衰亡期,个体死亡速度超过新生的速度。因此,整个群体呈现出负生长(R为负值)。 产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利,从而引起细胞内的分解代谢大大 超过合成代谢,继而导致菌体死亡。 5浸矿细菌生长曲线的绘制 浸矿细菌生长曲线的绘制关键是细菌数量。只需在细菌培养或浸出过程中每隔一定时 间,按前面介绍的方法测得细胞个数,后以时间为横坐标,以菌数为纵坐标画曲线即可。 5.5浸矿细菌活性的测定 细菌的活性是微生物浸矿的重要参数。在硫化矿浸出中,它表示细菌在单位时间内氧化 目的矿物的量,在细菌培养中,它表示细菌生长的活跃程度。目前,测定细菌活性的方法有 很多,主要有:亚铁离子氧化速率、CO2的固定速率(即吸收速率)、氧的消耗速率以及目的 矿物氧化速率等 5.5.1亚铁离子氧化速率法 氧化Feˉ为Fe是T.f菌的主要特征,Fe氧化速度快,表明细菌代谢旺盛,活性高。 实验室或工业生产上常用图2-8所示的装置来测定细菌活性。其它具有良好充气与搅拌功能 的装置也可。 测定方法如下:抽取25ⅷL待测菌液(或矿浆)于装置中,测定其中Fe2浓度,然后根 据测得的Fe2浓度值,补加FeSO·7H20至Fe浓度为10-15g/L,再准确测定Fe浓度,这 时的Fe浓度即为起始浓度C。 将装置置于恒温箱内充气培养2,温度保持在30℃,空气 再测菌液中Fe2浓度,即最终Fe2浓度C。 细菌活性可用下式计算 式中,A一测得的细菌活性(g/Lh) C一起始Fe2浓度(g/L); C—一最终Fe2浓度(g/L) 图28细菌活性测定装置 除此之外,还可在细菌培养或浸矿过程中,每隔一定时间取待测菌液(或矿浆)5-10mL
18 空气 （3）酸、醇、毒素等有害代谢产物的积累； （4）pH 值、氧化还原势等物化条件越来越不适宜等等。 4 衰亡期 在衰亡期，个体死亡速度超过新生的速度。因此，整个群体呈现出负生长（R 为负值）。 产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大 超过合成代谢，继而导致菌体死亡。 5 浸矿细菌生长曲线的绘制 浸矿细菌生长曲线的绘制关键是细菌数量。只需在细菌培养或浸出过程中每隔一定时 间，按前面介绍的方法测得细胞个数，后以时间为横坐标，以菌数为纵坐标画曲线即可。 5.5 浸矿细菌活性的测定 细菌的活性是微生物浸矿的重要参数。在硫化矿浸出中，它表示细菌在单位时间内氧化 目的矿物的量，在细菌培养中，它表示细菌生长的活跃程度。目前，测定细菌活性的方法有 很多，主要有：亚铁离子氧化速率、CO2 的固定速率(即吸收速率)、氧的消耗速率以及目的 矿物氧化速率等。 5.5.1 亚铁离子氧化速率法 氧化 Fe2+为 Fe3+是 T．f 菌的主要特征，Fe2+氧化速度快，表明细菌代谢旺盛，活性高。 实验室或工业生产上常用图 2-8 所示的装置来测定细菌活性。其它具有良好充气与搅拌功能 的装置也可。 测定方法如下：抽取 25mL 待测菌液（或矿浆）于装置中，测定其中 Fe2+浓度，然后根 据测得的 Fe2+浓度值，补加 FeSO4·7H2O 至 Fe2+浓度为 10~15g/L，再准确测定 Fe2+浓度，这 时的 Fe2+浓度即为起始浓度 C0。 将装置置于恒温箱内充气培养 2h，温度保持在 30℃， 再测菌液中 Fe2+浓度，即最终 Fe2+浓度 Cf。 细菌活性可用下式计算： A = (C0 −Cf )/2 式中， A——测得的细菌活性（g/L•h）； C0——起始 Fe2+浓度（g/L）； Cf——最终 Fe2+浓度（g/L）。 除此之外，还可在细菌培养或浸矿过程中，每隔一定时间取待测菌液（或矿浆）5~10mL， 图 2-8 细菌活性测定装置
用重铬酸钾容量法测得其中全铁、Fe“的量(全铁量测一次即可),计算不同时间段Fe2的氧 化率也能表征细菌的活性。 5.52细菌耗氧速率法 浸矿细菌大多数是好氧菌,其代谢过程中要消耗氧气,氧的消耗速率越快,说明细菌代 谢越旺盛,活性越高,故氧的消耗速率也可表征细菌的活性。细菌对氧的消耗速率,可用瓦 勃氏( Warbury)呼吸器测定,其构造如图2-9所示 250mL 250mL248mL 250mL 开始时 10min后 温压计 图2-9瓦勃氏呼吸器及测量操作示意图 T:开关F:反应器M:U形压力计 S:瓶侧臂C:CO2吸收器R:温度计 测定时,将1.5~2.5m矿浆放进瓦勃氏呼吸器的反应瓶中。反应瓶中央小瓶盛0.5mL20% 的KO溶液以吸收Oε。然后,将反应瓶接上测压计。整个呼吸器应置于恒温环境(如恒温 水浴),开动搅拌器。当测压计与环境温度相同时,反应开始,调节测压计U型管闭臂液面, 使达到零点,并关闭三通。反应一定时间后,细菌吸入氧气的体积△V可由U型测压计液柱 差的读数换算得出。细菌活性单位可用O2g/(Lh)或者mol/min表示 5.6浸矿微生物的育种 选育高效浸矿菌种是生物浸矿技术实现工业化的前提条件。对浸矿细菌进行性状改良 主要从以下几个因素考虑 (1)细菌生长速度(生物量增加速度) (2)硫化矿的氧化速度(活性) (3)对重金属的耐受能力 (4)细菌在矿物颗粒上的粘附速度及细菌在矿物颗粒和溶液中的分布情况;
19 用重铬酸钾容量法测得其中全铁、Fe2+的量（全铁量测一次即可），计算不同时间段 Fe2+的氧 化率也能表征细菌的活性。 5.5.2 细菌耗氧速率法 浸矿细菌大多数是好氧菌，其代谢过程中要消耗氧气，氧的消耗速率越快，说明细菌代 谢越旺盛，活性越高，故氧的消耗速率也可表征细菌的活性。细菌对氧的消耗速率，可用瓦 勃氏（Warbury）呼吸器测定，其构造如图 2-9 所示。 图 2-9 瓦勃氏呼吸器及测量操作示意图 T：开关 F： 反应器 M： U 形压力计 S：瓶侧臂 C：CO2 吸收器 R：温度计 测定时，将 1.5~2.5mL 矿浆放进瓦勃氏呼吸器的反应瓶中。反应瓶中央小瓶盛 0.5mL20% 的 KOH 溶液以吸收 CO2。然后，将反应瓶接上测压计。整个呼吸器应置于恒温环境（如恒温 水浴），开动搅拌器。当测压计与环境温度相同时，反应开始，调节测压计 U 型管闭臂液面， 使达到零点，并关闭三通。反应一定时间后，细菌吸入氧气的体积ΔV 可由 U 型测压计液柱 差的读数换算得出。细菌活性单位可用 O2 g/（L•h）或者 mol/min 表示。 5.6 浸矿微生物的育种 选育高效浸矿菌种是生物浸矿技术实现工业化的前提条件。对浸矿细菌进行性状改良， 主要从以下几个因素考虑： （1）细菌生长速度（生物量增加速度）； （2）硫化矿的氧化速度（活性）； （3）对重金属的耐受能力； （4）细菌在矿物颗粒上的粘附速度及细菌在矿物颗粒和溶液中的分布情况；
(5)菌种保藏的稳定性 选育高效菌种的方法除了从自然界筛选高品质的浸矿微生物外,更主要的是传统的驯 化、诱变育种、杂交育种和现代的原生质体融合技术以及基因工程育种。 5.6.1驯化培养 驯化是用某一特定因素长期处理某微生物的群体,同时不断地对它们进行接种传代,以 达到累积并选择相应的自发突变株的目的 现以驯化细菌对某种金属的耐受能力为例,说明其过程。首先在装有一定体积培养基的 三角瓶中加入较低浓度的该金属离子,然后接入要驯化的细菌进行恒温培养。开始细菌不适 应,要较长时间才能生长,待细菌适应并能正常生长后,将它再转移到含有更高浓度金属离 子的培养基中继续培养。依次类推,每转移一次都提高金属浓度,如此进行下去,就可以获 得对该金属离子具有较强耐性的菌株。表2-3表明了驯化氧化亚铁硫杆菌对铀耐受能力的过 程及成果,T.f耐受铀离子的能力从未驯化前的600mg/L到驯化后的1000mg/L,提高了 66.7% 表2-3氧化亚铁硫杆菌对铀适应性的驯化 氧化培养基中全部Fe2所需时间(d) (mg/L) 驯化前细菌 第二次转移 第三次转移 第四次转移 0 100 444444 44444447 44444 不生长 不生长 不生长 氧化亚铁硫杄菌活性的测定方法之一是测定其氧化二价铁为三价铁的速度。野生菌经过 驯化,活性极大地提高。表2-4是野生菌与驯化菌氧化二价铁的对比情况。驯化菌两天可使
20 （5）菌种保藏的稳定性； 选育高效菌种的方法除了从自然界筛选高品质的浸矿微生物外，更主要的是传统的驯 化、诱变育种、杂交育种和现代的原生质体融合技术以及基因工程育种。 5.6.1 驯化培养 驯化是用某一特定因素长期处理某微生物的群体，同时不断地对它们进行接种传代，以 达到累积并选择相应的自发突变株的目的。 现以驯化细菌对某种金属的耐受能力为例，说明其过程。首先在装有一定体积培养基的 三角瓶中加入较低浓度的该金属离子，然后接入要驯化的细菌进行恒温培养。开始细菌不适 应，要较长时间才能生长，待细菌适应并能正常生长后，将它再转移到含有更高浓度金属离 子的培养基中继续培养。依次类推，每转移一次都提高金属浓度，如此进行下去，就可以获 得对该金属离子具有较强耐性的菌株。表 2-3 表明了驯化氧化亚铁硫杆菌对铀耐受能力的过 程及成果，T．f 耐受铀离子的能力从未驯化前的 600mg/L 到驯化后的 1000mg/L，提高了 66.7%[17]。 表 2-3 氧化亚铁硫杆菌对铀适应性的驯化 铀浓度 （mg/L） 氧化培养基中全部 Fe2+所需时间（d） 驯化前细菌 第一次转移 第二次转移 第三次转移 第四次转移 0 4 4 4 4 4 100 4 4 4 4 4 200 4 4 4 4 4 300 7 4 4 4 4 400 7 4 4 4 4 500 7 4 4 4 4 600 7 10 4 4 4 700 不生长 10 7 7 4 800 不生长 10 7 7 900 10 7 7 1000 不生长 10 10 氧化亚铁硫杆菌活性的测定方法之一是测定其氧化二价铁为三价铁的速度。野生菌经过 驯化，活性极大地提高。表 2-4 是野生菌与驯化菌氧化二价铁的对比情况。驯化菌两天可使