表2-2常见浸矿细菌的培养基 培养基名称 组成(g/L) 培养对象 (NH4)2SO40.15 KHPO4 0.05 铁氧化沟端螺菌 KCI 0.05 Ca(NO3)20.01 氧化铁铁杆菌 MgSO4·7H2O0.0 蒸馏水1000mL 氧化亚铁硫杆菌 FeSO47H2O10%(W/)溶液10mLpH20 (NH4)2SO43.0 KCI 0.1 MgSO4·7H2O0.5 KHPO4 0.5 氧化铁铁杆菌 Ca(NO3)0.01 蒸馏水700mL 氧化亚铁硫杆菌 eSO4·7H2O14.7%W/)溶液300mLpH2 FeSO4·7H2O0.01 NH4)2SO40.2 硫磺粉10 蒸馏水1000mL Waksman 氧化硫硫杆菌 MgSO4·7H200.5 CaCh2·2H2O025 pH20-3.5 硫磺粉10 KHPO, 4 MgSO4·7H200.3 氧化硫硫杆菌 FeSO4·7H2O0.01 CaCh2·2H2O0.25 蒸馏水1000mL pH20~3. (NH4)2SO40.2 Cach 0.2 KHPO4 3 Na2S2O3·5H2O Colmer 氧化亚铁硫杆菌 MgSO4·7H200.1 蒸馏水1000mL H1.5~2. 酵母浸出液1gL,及A溶液: NH4)2SO4 1. 3g ZnSO4 0.22mg K2HPO4 0.28g s 10g 硫化裂叶菌 叶硫球菌FeCl37H2O0.02g CoSO4 0.01mg Sulfolobus MnCl2·4H2O1.8mg NaB4O7·10HO4.5mg CuCh2·2H2O0.05mg MgSO4. 7H20 0.25g Na,MoO42H,O 0.03mg VoSO4·H2O003mg
6 表 2-2 常见浸矿细菌的培养基 培养基名称 组 成 (g/L) 培养对象 Leathen (NH4)2SO4 0.15 K2HPO4 0.05 铁氧化沟端螺菌 氧化铁铁杆菌 氧化亚铁硫杆菌 KCl 0.05 Ca(NO3)2 0.01 MgSO4•7H2O 0.05 蒸馏水 1000mL FeSO4•7H2O 10%(W/V) 溶液 10mL pH 2.0 9K (NH4)2SO4 3.0 KCl 0.1 氧化铁铁杆菌 氧化亚铁硫杆菌 MgSO4•7H2O 0.5 K2HPO4 0.5 Ca(NO3)2 0.01 蒸馏水 700mL FeSO4•7H2O 14.7%(W/V)溶液 300mL pH 2.0 Waksman FeSO4•7H2O 0.01 (NH4)2SO4 0.2 氧化硫硫杆菌 硫磺粉 10 蒸馏水 1000mL MgSO4•7H2O 0.5 CaCl2•2H2O 0.25 pH 2.0~3.5 ONM (NH4)2SO4 2 硫磺粉 10 氧化硫硫杆菌 K2HPO4 4 MgSO4•7H2O 0.3 FeSO4•7H2O 0.01 CaCl2•2H2O 0.25 蒸馏水 1000mL pH 2.0~3.5 Colmer (NH4)2SO4 0.2 CaCl2 0.2 氧化亚铁硫杆菌 K2HPO4 3 Na2S2O3•5H2O 5 MgSO4•7H2O 0.1 蒸馏水 1000mL pH 1.5~2. 酵母浸出液 1g/L，及 A 溶液: 硫化裂叶菌 （Sulfolobus） (NH4)2SO4 1.3g ZnSO4 0.22mg K2HPO4 0.28g S 10g 叶硫球菌 FeCl3•7H2O 0.02g CoSO4 0.01mg MnCl2•4H2O 1.8mg Na2B4O7•10H2O 4.5mg CuCl2•2H2O 0.05mg MgSO4•7H2O 0.25g Na2MoO4•2H2O 0.03mg VoSO4•H2O 0.03mg
CaCh·2H2O0.07g 蒸馏水1000mL pH2.0 (NH4)2SO40.5 KHPO: 0.2 Nacl 0 黄铁矿粉2% 嗜热硫氧化 Ca(NO3)·4H2O0.0 MgSO4·7H200.3 嗜热硫氧化菌 哮母浸出粉2g 蒸馏水1000mL pH2.5 培养基按外观物理状态可分 1液体培养基( Liquid medium) 在液体培养基中营养物质以溶质状态溶解于其中,使微生物能更充分地接触和利用养 料,因而也能更好地积累代谢产物。因此,在实验室中,液体培养基主要用于生理、代谢研 究及获得大量菌体:在生产中,则用于大规模生产、发酵 9K、 Heathen培养基由于有易被氧化的FeS04·7H20,一旦温度超过50℃,其中的Fe2 就会自发地快速氧化,并生成硫酸高铁、水合硫酸铁及黄钾铁钒沉淀。解决的办法有: (1)调节培养基的pH值至1.5。在配制上述两种培养基时,p值是一个很重要的考虑 因素。pH值高则培养基经高温灭菌后,会在瓶底生成沉淀,而使溶液浑浊:;实验表明,在 pH值低的溶液中,培养基的各成分溶解度大些。 (2)减少铁盐及磷酸盐的用量并补充少量的酵母膏。调整后的低磷酸盐培养基组成如 下(g/L):KlPO40.4、MgSO°7H200.4、(NH4)2S00.4、FeS0·7H027.8、酵母膏0.2(也 可用谷胱苷肽0.1或半胱氨酸0.1);pH=1.5 (3)将FeS04·TH0溶液单独过滤灭菌,再与用高温灭菌的培养基中的其他无机盐溶液 混合。这种方法得到的培养基Fe2被氧化成Fe的量少,培养基为浅绿色澄清溶液 2半固体培养基(Semi- solid medium) 在液体培养基中加入0.2~0.5%的琼脂作凝固剂,就可得到半固体培养基。半固体培养基 呈现出在容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后能破散的状态。半固体培养基在微生物实验 中有许多独特的用途,如细菌的动力观察(在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种,观察 细菌的运动能力),各种厌氧菌的培养及菌种保藏等。绝大多数的浸矿细菌是能运动的,可 以通过这种方法来鉴定菌种 3固体培养基( Solid medium)
7 CaCl2•2H2O 0.07g 蒸馏水 1000mL pH 2.0 嗜热硫氧化 菌 (NH4)2SO4 0.5 K2HPO40.2 嗜热硫氧化菌 NaCl 0.2 黄铁矿粉 2% Ca(NO3)2•4H2O 0.07 MgSO4•7H2O 0.3 酵母浸出粉 2g 蒸馏水 1000mL pH 2.5 培养基按外观物理状态可分： 1 液体培养基（Liquid medium） 在液体培养基中营养物质以溶质状态溶解于其中，使微生物能更充分地接触和利用养 料，因而也能更好地积累代谢产物。因此，在实验室中，液体培养基主要用于生理、代谢研 究及获得大量菌体；在生产中，则用于大规模生产、发酵。 9K、 Leathen 培养基由于有易被氧化的 FeSO4•7H2O，一旦温度超过 50℃，其中的 Fe2+ 就会自发地快速氧化，并生成硫酸高铁、水合硫酸铁及黄钾铁钒沉淀。解决的办法有： （1）调节培养基的 pH 值至 1.5。在配制上述两种培养基时，pH 值是一个很重要的考虑 因素。pH 值高则培养基经高温灭菌后，会在瓶底生成沉淀，而使溶液浑浊；实验表明，在 pH 值低的溶液中，培养基的各成分溶解度大些。 （2）减少铁盐及磷酸盐的用量并补充少量的酵母膏。调整后的低磷酸盐培养基组成如 下（g/L）：K2HPO4 0.4、 MgSO4•7H2O 0.4、(NH4)2SO4 0.4、FeSO4•7H2O 27.8、酵母膏 0.2（也 可用谷胱苷肽 0.1 或半胱氨酸 0.1）；pH=1.5。 （3）将 FeSO4•7H2O 溶液单独过滤灭菌，再与用高温灭菌的培养基中的其他无机盐溶液 混合。这种方法得到的培养基 Fe2+被氧化成 Fe3+的量少，培养基为浅绿色澄清溶液。 2 半固体培养基（Semi-solid medium） 在液体培养基中加入 0.2~0.5%的琼脂作凝固剂，就可得到半固体培养基。半固体培养基 呈现出在容器倒放时不致流下、但在剧烈振荡后能破散的状态。半固体培养基在微生物实验 中有许多独特的用途，如细菌的动力观察（在半固体直立柱中央进行细菌的穿刺接种，观察 细菌的运动能力），各种厌氧菌的培养及菌种保藏等。绝大多数的浸矿细菌是能运动的，可 以通过这种方法来鉴定菌种。 3 固体培养基（Solid medium）
在液体培养基中加入1%2%琼脂或5%~12%明胶作凝固剂,就可制成遇热可融化、冷却 后则凝固的固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保藏、鉴定等。T.f菌种 在琼脂培养基上生长很弱,难以形成菌落,为菌种分离及遗传操作带来了很大困难。出现这 种情况的主要原因是琼脂在酸性条件下生成的水解产物对菌体有毒害作用。针对这个问题可 采用多种方法克服: (1)适当地降低琼脂浓度,小于2% (2)控制p值在3.0左右,pH值太低,琼脂粉因水解而不凝固:皿值太高,细菌的 生长缓慢 (3)适当降低FeS0·7HO和磷酸盐的浓度,分别不宜超过22.2g/L和0.05g/L (4)选用质量较好的琼脂,如琼脂糖等; (5)经过多年探索,彭基斌、颜望明等硏究设计出一种新的适用于氧化亚铁硫杄菌遗 传操作的固体培养基,称之为2:2培养基。组成为:FeS0·7H02‰、Na2S2O3·5H02‰、 (MH)2SO44.5‰、KC10.15‰、MgSO·7H200.75‰、琼脂粉6‰,pH4.6~4.8。这种培养基 含两种能源,亚铁和硫代硫酸钠,p在4.6~4.8范围内,至少卡那霉素(300μg/m)和链 霉素(200~300μg/m)可以在该培养基上使用。尽管氧化亚铁硫杆菌形成菌落需要两周时 间,但菌落形成率相对较高。在2:2培养基上生长,形态特征明显、稳定,氧化亚铁硫杆 菌、抗卡那霉素和抗链霉素的自发突变率均低于103,这就为利用这两种抗生素为遗传标记 选择转移接合子奠定了基础。 (6)除此之外还可采用ISP固体培养基。ISP固体培养基的配制田:溶液A,300mL 蒸馏水中加入FeSO3·TH20,配成浓度33.4%的溶液;用6MH2SO调p值至2.5,搅拌至几乎 无色,用细菌滤膜灭菌后,置于室温中。溶液B,550mL蒸馏水中加入(NH)2S06.0g、KCl0.2g、 MgSO1·TH201.0g、Ca(NO3)20.02g,调p值至3.0,121℃,1.2latm,灭菌15min。溶液C, 纯化的琼脂7.0g加到150m水中,浸泡15min,在1升锥形瓶中升温至121℃,1.21atm灭 菌5min。B和C从高压釜中取出,在空气中冷却5min,然后将B、C混合,将A加入上述 混合物,并搅匀。三者混合物倒于平板上,深度约为培养皿的高度的一半 2.2.2浸矿徽生物的采集、分离 从自然界中采集菌种及在实验室中培养所获得的菌种是矿物生物技术取得成就的第 步。对于研究与使用者而言,工作微生物可从菌种保藏机构直接购得。但多数情况,仍需从 自然界中采集。 浸矿微生物可能存在的地点有以下一些:
8 在液体培养基中加入 1%~2%琼脂或 5%~12%明胶作凝固剂，就可制成遇热可融化、冷却 后则凝固的固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保藏、鉴定等。T．f 菌种 在琼脂培养基上生长很弱，难以形成菌落，为菌种分离及遗传操作带来了很大困难。出现这 种情况的主要原因是琼脂在酸性条件下生成的水解产物对菌体有毒害作用。针对这个问题可 采用多种方法克服： （1）适当地降低琼脂浓度，小于 2%； （2）控制 pH 值在 3.0 左右，pH 值太低，琼脂粉因水解而不凝固；pH 值太高，细菌的 生长缓慢； （3）适当降低 FeSO4•7H2O 和磷酸盐的浓度，分别不宜超过 22.2g/L 和 0.05g/L[8，9] ； （4）选用质量较好的琼脂，如琼脂糖等； （5）经过多年探索，彭基斌、颜望明等研究设计出一种新的适用于氧化亚铁硫杆菌遗 传操作的固体培养基，称之为 2∶2 培养基[10]。组成为：FeSO4•7H2O 2‰、Na2S2O3•5H2O 2‰、 (NH4)2SO4 4.5‰、KCl 0.15‰、MgSO4•7H2O 0.75‰、琼脂粉 6‰，pH4.6~4.8。这种培养基 含两种能源，亚铁和硫代硫酸钠，pH 在 4.6~4.8 范围内，至少卡那霉素（300μg/mL）和链 霉素（200~300μg/mL）可以在该培养基上使用。尽管氧化亚铁硫杆菌形成菌落需要两周时 间，但菌落形成率相对较高。在 2∶2 培养基上生长，形态特征明显、稳定，氧化亚铁硫杆 菌、抗卡那霉素和抗链霉素的自发突变率均低于 10- 8，这就为利用这两种抗生素为遗传标记、 选择转移接合子奠定了基础。 （6）除此之外还可采用 ISP 固体培养基。ISP 固体培养基的配制[11]：溶液 A，300 mL 蒸馏水中加入 FeSO4•7H2O，配成浓度 33.4%的溶液；用 6MH2SO4 调 pH 值至 2.5，搅拌至几乎 无色，用细菌滤膜灭菌后，置于室温中。溶液 B，550mL 蒸馏水中加入(NH4)2SO4 6.0g、KCl 0.2g、 MgSO4·7H2O 1.0g、Ca(NO3)2 0.02g，调 pH 值至 3.0，121℃，1.21atm，灭菌 15min。溶液 C， 纯化的琼脂 7.0g 加到 150mL 水中，浸泡 15min，在 1 升锥形瓶中升温至 121℃，1.21atm 灭 菌 5min。B 和 C 从高压釜中取出，在空气中冷却 5 min，然后将 B、C 混合，将 A 加入上述 混合物，并搅匀。三者混合物倒于平板上，深度约为培养皿的高度的一半。 2.2.2 浸矿微生物的采集、分离 从自然界中采集菌种及在实验室中培养所获得的菌种是矿物生物技术取得成就的第一 步。对于研究与使用者而言，工作微生物可从菌种保藏机构直接购得。但多数情况，仍需从 自然界中采集。 浸矿微生物可能存在的地点有以下一些：
(1)矿山、矿堆或尾矿中流淌的酸性水 (2)矿石本身; (3)热泉水样或矿浆 在选择采集地点时,应结合将来的工作目的选择合适的地方,例如,研究细菌浸出铀 矿的影响因素,则最好到铀矿山采集菌种。 现以浸矿细菌中最常见的氧化亚铁硫杆菌为例,介绍浸矿微生物的采集、分离的基本 方法 氧化亚铁硫杆菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性(pH<4)矿坑水中,因此可到这 些矿山采集,采集的步骤如下 取50~25omL细口瓶,洗净并配好胶塞,用牛皮纸包扎好瓶口,置于120℃烘箱灭菌 20min,待冷却后即可作为细菌取样瓶。带取样瓶到矿山取酸性矿坑水。如矿坑水的pH为 1.5~3.5并呈红棕色(说明有Fe存在),则很可能存在氧化亚铁硫杆菌,可对此水样进行分 离培养。取样时将牛皮纸取下,用一只手拔去瓶塞,另一只手持瓶接取或舀取水样,其量不 宜超过瓶容量的2/3。(若所取样不是水样而是已被氧化成棕褐色的潮湿矿块,则应在灭菌 的取样瓶中,加入约占瓶容积1/3的液体培养基)取样后,立即盖好胶塞,并用牛皮纸包好, 在瓶上贴上标签,标明取样地点及时间 为了便于将来可用矿物培养基培养和保存细菌,可随便采取采样矿山的矿样少许,这 样的矿样为该菌所适应,十分适合于该菌的培养 为了分离、培养所需细菌,还需配制好专供这种菌生长的 Leather或K培养基,配好 的培养基用蒸气灭菌15min,然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的100毫升的 角瓶中。塞好棉塞置于20~30℃的恒温条件下静置培养(或振荡培养)7~10天。由于细菌 生长繁殖,三角瓶中培养基的颜色由浅绿色变为红棕色,最后在瓶底出现高铁沉淀(与空白 对照)。选择变化最快,颜色最深的三角瓶,在瓶中取1毫升培养液,接种到装有新培养基 的三角瓶中,同样培养。培养液比头一次更快地变成红棕色,以后按同样方法反复转移培养, 至少十次以上。每转移一次,接种量逐渐减少,只需1~2滴就可。而所培养的细菌却越来越 活跃,只需培养3-5天就可把培养基中的Fe氧化成Fe。在转移培养中,借助培养基的高 酸度及高浓度亚铁和高铁离子,可杀死和淘汰一些杂菌,氧化亚铁硫杆菌可得到充分繁殖, 活性越来越好。 可用如下方法对培养的氧化亚铁硫杆菌进行初步检査和鉴定 (1)肉眼观察
9 （1）矿山、矿堆或尾矿中流淌的酸性水； （2）矿石本身； （3）热泉水样或矿浆。 在选择采集地点时，应结合将来的工作目的选择合适的地方，例如，研究细菌浸出铀 矿的影响因素，则最好到铀矿山采集菌种。 现以浸矿细菌中最常见的氧化亚铁硫杆菌为例，介绍浸矿微生物的采集、分离的基本 方法。 氧化亚铁硫杆菌广泛存在于金属硫化矿山、煤矿的酸性(pH<4)矿坑水中，因此可到这 些矿山采集，采集的步骤如下： 取 50~250mL 细口瓶，洗净并配好胶塞，用牛皮纸包扎好瓶口，置于 120℃烘箱灭菌 20min，待冷却后即可作为细菌取样瓶。带取样瓶到矿山取酸性矿坑水。如矿坑水的 pH 为 1.5~3.5 并呈红棕色（说明有 Fe3+存在），则很可能存在氧化亚铁硫杆菌，可对此水样进行分 离培养。取样时将牛皮纸取下，用一只手拔去瓶塞，另一只手持瓶接取或舀取水样，其量不 宜超过瓶容量的 2/3。（若所取样不是水样而是已被氧化成棕褐色的潮湿矿块，则应在灭菌 的取样瓶中，加入约占瓶容积 1/3 的液体培养基）取样后，立即盖好胶塞，并用牛皮纸包好， 在瓶上贴上标签，标明取样地点及时间。 为了便于将来可用矿物培养基培养和保存细菌，可随便采取采样矿山的矿样少许，这 样的矿样为该菌所适应，十分适合于该菌的培养。 为了分离、培养所需细菌，还需配制好专供这种菌生长的 Leathen 或 9K 培养基，配好 的培养基用蒸气灭菌 15min，然后在无菌操作下分装于数个事先洗净并灭菌的 100 毫升的三 角瓶中。塞好棉塞置于 20~30℃的恒温条件下静置培养（或振荡培养）7~10 天。由于细菌 生长繁殖，三角瓶中培养基的颜色由浅绿色变为红棕色，最后在瓶底出现高铁沉淀（与空白 对照）。选择变化最快，颜色最深的三角瓶，在瓶中取 1 毫升培养液，接种到装有新培养基 的三角瓶中，同样培养。培养液比头一次更快地变成红棕色，以后按同样方法反复转移培养， 至少十次以上。每转移一次，接种量逐渐减少，只需 1~2 滴就可。而所培养的细菌却越来越 活跃，只需培养 3~5 天就可把培养基中的 Fe 2+氧化成 Fe 3+。在转移培养中，借助培养基的高 酸度及高浓度亚铁和高铁离子，可杀死和淘汰一些杂菌，氧化亚铁硫杆菌可得到充分繁殖， 活性越来越好。 可用如下方法对培养的氧化亚铁硫杆菌进行初步检查和鉴定： （1）肉眼观察
如有该菌生长,则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁,培养基的颜色由浅绿色变成红棕 色,最后产生高铁沉淀。(需作空白对照,因为空气也能将亚铁氧化成Fe",培养基的颜色 会由浅绿色变成黄色,并会产生沉淀附于瓶底。) (2)重铬酸钾容量法测定 用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁氧化成高铁的氧化率。用KCr2O-HgCl2法或 KCr02-SnCl2的方法测定培养基中的全铁量,再用KcrO或KnO滴定Fe2(酸性环境) 以此计算得Fe"的氧化率,氧化率高的,说明细菌生长旺盛。 (3)显微镜观察 用简单染色或革兰氏染色法对所培养的细菌进行染色,在显微镜下观察是否有T.f存 在。 2.2.3浸矿微生物的纯化 用上述方法获得的菌种往往不纯,其中会有杂菌。要想得到纯菌种,则需要作平板分离 浸矿细菌的分离纯化一般采用稀释涂布平板法、平板划线分离法和终点稀释法。 1稀释涂布平板法 稀释涂布平板法是一种有效而常用的微生物纯种分离方法。它是将一定浓度、一定量的 待分离菌液移到已凝固的培养基平板上,再用涂布棒迅速地将其均匀涂布,使长出单菌落而 达到分离的目的,见图2-3 各9mPH=25硫酸溶液 原菌液 涂布平板 ℃培养 挑单菌落 单菌落培养 图2-3稀释涂布平板分离示意图
10 如有该菌生长，则培养基中的亚铁将被氧化变成高铁，培养基的颜色由浅绿色变成红棕 色，最后产生高铁沉淀。（需作空白对照，因为空气也能将亚铁氧化成 Fe3+，培养基的颜色 会由浅绿色变成黄色，并会产生沉淀附于瓶底。） （2）重铬酸钾容量法测定 用重铬酸钾容量法测定培养液中亚铁氧化成高铁的氧化率。用 K2Cr2O7-HgCl2 法或 K2Cr2O7-SnCl2 的方法测定培养基中的全铁量，再用 K2Cr2O7或 KMnO4 滴定 Fe2+（酸性环境）[12]， 以此计算得 Fe2+的氧化率，氧化率高的，说明细菌生长旺盛。 （3）显微镜观察 用简单染色或革兰氏染色法对所培养的细菌进行染色，在显微镜下观察是否有 T．f 存 在。 2.2.3 浸矿微生物的纯化 用上述方法获得的菌种往往不纯，其中会有杂菌。要想得到纯菌种，则需要作平板分离。 浸矿细菌的分离纯化一般采用稀释涂布平板法、平板划线分离法和终点稀释法。 1 稀释涂布平板法[13] 稀释涂布平板法是一种有效而常用的微生物纯种分离方法。它是将一定浓度、一定量的 待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒迅速地将其均匀涂布，使长出单菌落而 达到分离的目的，见图 2-3。 原菌液 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 单菌落培养 各9 硫酸溶液 涂布平板 30℃培养 挑单菌落 10-6 图 2-3 稀释涂布平板分离示意图