目录实验一质粒DNA的小量提取实验二质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验三重组DNA分子的构建实验四重组子的检测及限制性酶切鉴定实验五大肠杆菌感受态细胞的制备实验六质粒DNA分子导入原核细胞实验七聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验八植物基因组DNA的提取实验十植物总RNA的提取及其电泳鉴定综合性设计性实验：与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术
目 录 实验一 质粒DNA的小量提取 实验二 质粒DNA的酶切和电泳鉴定 实验三 重组DNA分子的构建 实验四 重组子的检测及限制性酶切鉴定 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验六 质粒DNA分子导入原核细胞 实验七 聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断 实验八 植物基因组DNA的提取 实验十 植物总RNA的提取及其电泳鉴定 综合性设计性实验：与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆 实验一 质粒DNA的小量提取 一、目的要求 1、 掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术
2掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、仪器、材料和试剂1）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计2）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a3）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖（1）用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。溶液2（变性液）：0.2mol/LNaOH，1%SDS溶液3（醋酸钾溶液）：60mL的5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O.PH4.8(2)缓冲液TBE缓冲液（10X）：称取Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10X贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTApH8.0其中含有RNase20μg/Ml(3)其他试剂异丙醇，70%乙醇等四、操作步骤1．质粒DNA的提取1）培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基中，37°c震荡培养8h一16h2）取液体培养液1.5mL于Eppendorf管中，转速10000r/min离心1min，去掉上清夜，加入100μLGET溶液，充分混匀后在室温下放置5min。3）加入200μL新配置的变性液，颠倒2次-3次使之混匀，冰上放置5min。4）加入150μL冰冷的醋酸钾溶液（Ph4.8），颠倒数次混匀后，冰上放置5min。5）用台式高速离心机，转速为10000r/min，将上清液移入另一干净离心管，并加等体积异内醇混匀，室温放置5min后，12000r/min离心5min，弃去上清液。6）沉淀用70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。7）加入20μL含有RNase20ug/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解。8）一20℃保存备用。2.用分光光度计测定质粒DNA的浓度1）用TE或蒸留水将待测DNA样品做1：20或更高倍数的稀释。2）用TE或蒸馏水作为空白，在波长为260nm，280nm，及310nm处调节分光光度计读数至零。3）加入DNA稀释液于上3波长处读取OD值。4）记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下：
2、 掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法 二、基本原理 在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭 合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细 菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是 一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差 异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而 变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以 pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液 中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子 RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、仪器、材料和试剂 1） 仪器 微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、 分光光度计 2） 材料 含有质粒的大肠杆菌DH5a 3） 试剂及溶液 LB培养基、葡萄糖 （1） 用于碱法提取质粒DNA的溶液 溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L TrisHClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。 溶液2（变性液）：0.2mol/L NaOH，1%SDS 溶液3（醋酸钾溶液）：60mL的5mol/L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O. PH4.8 (2)缓冲液 TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定 容到1000mL高压灭菌作为10Χ贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0, 其中含有RNase20μg/Ml (3)其他试剂 异丙醇,70%乙醇等 四、操作步骤 1．质粒DNA的提取 1） 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基中，37oC震荡培养8h—16h 2） 取液体培养液1.5mL于Eppendorf管中,转速10000r/min离心1min,去掉上清夜,加入 100μLGET溶液,充分混匀后在室温下放置5min。 3） 加入200μL新配置的变性液，颠倒2次-3次使之混匀，冰上放置5min。 4） 加入150μL冰冷的醋酸钾溶液（Ph4.8），颠倒数次混匀后，冰上放置5 min。 5） 用台式高速离心机，转速为10000r/min，将上清液移入另一干净离心管，并加等体积异丙醇 混匀，室温放置5min后，12000r/min离心5min，弃去上清液。 6） 沉淀用70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。 7） 加入20μL含有RNase20μg/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物，室温放置30min以 上，使DNA充分溶解。 8） —20oC保存备用。 2．用分光光度计测定质粒DNA的浓度 1）用TE或蒸馏水将待测DNA样品做1：20或更高倍数的稀释。 2）用TE或蒸馏水作为空白，在波长为260nm，280nm，及310nm处调节分光光度计读数至零。 3）加入DNA稀释液于上3波长处读取OD值。 4）记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下：
对于ssDNA：[ssDNA]=33X（OD260—OD310）X稀释倍数对于dsDNA：[dsDNA]=50X（OD260一OD310）X稀释倍数对于ssRNA：[ssRNA]=40X（OD260—OD310）X稀释倍数五、问题讨论1．提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌：分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异内丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到质粒DNA。2.利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在260nm和280nm波长下均有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260/OD280是固定的，对DNA样品而言其值大约为1.8一2.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。六：试验结果计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度。实验二.质粒DNA的酶切和电泳鉴定一，实验目的1.了解限制性内切酶酶解DNA分子的原理2.学习琼脂糖凝胶电泳分离和纯化DNA片断的方法二.基本原理通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶称作核酸酶，是DNA重组技术得以创立的工具酶。其中能识别双链DNA分子中的某一特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶称为限制性内切酶，主要是从原核生物中分离和纯化出来的，目前已发现的限制性内切酶有数百种。例如和HindIII是常用的两种限制性内切酶，其识别序列和切口是：
对于ssDNA：[ssDNA]=33X（OD260—OD310）X稀释倍数 对于dsDNA：[dsDNA]=50X（OD260—OD310）X稀释倍数 对于ssRNA：[ssRNA]=40X（OD260—OD310）X稀释倍数 五、问题讨论 1． 提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和 裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可 使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而 当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离 心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异丙醇或乙醇沉 淀后洗涤，可得到质粒DNA。 2． 利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组 成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而 对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也 会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好 的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不 准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别 是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在260nm和280nm 波长下均有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260 /OD280是固定的，对DNA样品 而言其值大约为1.8－2.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测 定样品OD260 /OD280的方法来分析核酸样品的纯度。 六．试验结果 计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度。 实验二. 质粒DNA的酶切和电泳鉴定 一．实验目的 1. 了解限制性内切酶酶解DNA分子的原理 2. 学习琼脂糖凝胶电泳分离和纯化DNA片断的方法 二．基本原理 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断 裂的蛋白酶称作核酸酶，是DNA重组技术得以创立的工具酶。其中能识别双链DNA分子中的 某一特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶称为限制性内切酶，主要是从原核生物 中分离和纯化出来的，目前已发现的限制性内切酶有数百种。例如和HindⅢ是常用的两种限 制性内切酶，其识别序列和切口是：
ECoRI:GAATTCHindIII: A AGCT TC TTAAGT TCGA -A如上所示，GAATTC和AAGCTT核苷酸序列表示识别位点，线条表示切口。某种限制性内切酶对特定环状质粒DNA有多少个酶切位点，就能产生多少个酶解片断，酶切后的片断用琼脂糖凝胶电泳来分离鉴定，进而制作DNA分子的限制性酶切图谱。电泳是分离和纯化DNA片断的常用技术，把DNA样品加入一块包含电解质的多孔支持介质的样品孔中，并置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶阻力之间的比率就会降低，不同长度DNA片断就会表现出不同的迁移率，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。该过程可通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物可以提供一个用于确定DNA片断大小的标准。依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。三、仪器、材料和试剂1.仪器微量移液器常用玻璃器血电泳仪电泳槽凝胶成像系统2.材料实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA3.试剂EcoRI酶解缓冲液（10×）：1mol/LpH7.5Tris.HC10.5mol/LNaC1, 0. 1mo1/LMgC12HindIII酶解缓冲液（10×）：0.1mol/LpH7.4Tris.HC1,1mo1/L NaC1,0.07mo1/LMgC12TBE缓冲液(10X）：称取Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（Ph8.0）40ML，用H20定容到1000mL高压灭菌作为10X贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。上样液（6×）：0.25%溴酚蓝，质量浓度为40%蔗糖水溶液溴化乙啶染色液（10mg/M1）：在20mLH20中溶解0.2克溴化乙啶，混匀后于4℃避光保存。四．操作步骤1)将上一试验提纯并溶于20μLTE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需试剂.质粒样品酶液酶解缓冲液自提质粒16μL2 μL2 μL标准质粒16μL2 μ L2 μL加样后小心混匀，置于37℃水浴中酶解半小时（有时可以长一点，数小时或过夜），然后向管中加入上样液4μL后等待电泳分析。2)琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8克琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mLTBE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯或小平血，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。此外也可用沸水浴或高压锅加热溶解琼脂糖。3)胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晒干放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。4）用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔中，每加完一个样品，换一个加样头，加样时应防止碰环样品孔周围的凝胶面
EcoRⅠ： G AATT C HindⅢ: A AGCT T C TTAA G T TCGA A 如上所示，GAATTC和AAGCTT核苷酸序列表示识别位点，线条表示切口。某种限制 性内切酶对特定环状质粒DNA有多少个酶切位点，就能产生多少个酶解片断，酶切后的片断 用琼脂糖凝胶电泳来分离鉴定，进而制作DNA分子的限制性酶切图谱。 电泳是分离和纯化DNA片断的常用技术，把DNA样品加入一块包含电解质 的多孔支持介质的样品孔中，并置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子的 双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自 凝胶阻力之间的比率就会降低，不同长度DNA片断就会表现出不同的迁移率，因而可依据DNA 分子的大小来使其分离。该过程可通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行 电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物可以提供一个用于确定DNA片断大小的标准。依 据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下琼 脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。 三． 仪器、材料和试剂 1.仪器 微量移液器 常用玻璃器皿 电泳仪 电泳槽 凝胶成像系统 2.材料 实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA 3.试剂 EcoRⅠ酶解缓冲液（10×）：1mol/LpH 7.5 Tris .HCl,0.5mol/L NaCl,0.1mol/LMgCl2. HindⅢ酶解缓冲液（10×）：0.1mol/LpH 7.4 Tris .HCl,1mol/L NaCl,0.07mol/LMgCl2. TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10Χ贮藏，稀释10倍 后作为工作液使用。 上样液（6×）：0.25%溴酚蓝，质量浓度为40%蔗糖水溶液 溴化乙啶染色液（10mg/Ml）：在20mLH2O中溶解0.2克溴化 乙啶，混匀后于4℃避光保存。 四．操作步骤 1)将上一试验提纯并溶于20μL TE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需 试剂. 质粒 样品 酶解缓冲液 酶液 自提质粒 16μL 2μL 2μL 标准质粒 16μL 2μL 2μL 加样后小心混匀，置于37℃水浴中酶解半小时（有时可以长一点，数小时或过夜），然后 向管中加入上样液4μL后等待电泳分析。 2)琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8克琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mLTBE工作液，瓶口 倒扣一个小烧杯或小平皿，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。此外也可用沸水浴 或高压锅加热溶解琼脂糖。 3)胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晒干放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷 却至65℃左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开， 直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，凝固完全后，轻轻 拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电 泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。 4)用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔中，每加完一个样品，换一个加样头，加 样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面
5)对加完样后的凝胶板通电进行电泳：建议在80V一100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离到胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压下，线性DNA片断的迁移速度与电压成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片断泳动度的增加是有差别的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小，为了获得电泳分离DNA片断的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm.电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以低温为好，也可在室温下进行，在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳。6）染色观察：将电泳完成后的凝胶浸在含有溴化乙啶（浓度为0.5μg/mL）的电泳缓冲液中，染色约20min，在紫外灯（254nm或302nm波长）下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。一般紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应带上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼晴遭受紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳条谱。五：问题讨论1）在细胞内质粒DNA是共价闭合环状DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛的分子叫做开还DNA（ocDNA）：若两条链在同一处或其附近断裂则变成线性DNA分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：CccDNA>直线DNA>ocDNA，因此在本次试验中琼脂糖凝胶电泳上自制质粒呈现3条带。琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物，当熔化再凝固后就会形成固体基2）质，其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量。带负电荷的核酸就可以在这种基质中，在电场的作用下向阳极移动。核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数：1.DNA的分子大小；2.琼脂糖的浓度；3.DNA的构象；4.所加电压；5.电场方向；6.碱基组成与温度：7.嵌入的染料：8.电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影响是：一定大小的DNA片断，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同；在一定浓度的琼脂糖凝胶中，核酸片断的迁移率与其相对分子质量大小相反。3)溴化乙啶的化学名称是3,8-二氨基一5-乙基一6-苯基菲锭溴盐（简称EB或EtBr）由于溴化乙啶分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带呈现出桔黄色的荧光，便于检测。EB能插入DNA分子中的碱基对之间，完成与DNA的结合。EB染色具有以下特点：1.操作简便快速，室温下染色15min-20min；2.不会使核酸断裂；3.灵敏度高，10ng或更少的DNA就可检出；4.可以加到样品中，随时用紫外追踪检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配置和使用溴化乙啶的器血或物品，必须经特殊处理后再进行清洗或弃去。4）限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶，即限制性内切酶和DNA甲基化酶。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生物功能相反，前者是限制作用，后者是修饰作用。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，这就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破还。对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化就会被切割破还。六：实验结果分析：实验三重组DNA分子的构建一.实验目的：了解DNA克隆技术的概念及其在分子生物学研究中重大意义，掌握DNA重组的方法.二，实验原理
5)对加完样后的凝胶板通电进行电泳：建议在80V—100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移 动到距离到胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压下，线性DNA片断的迁移速度与电压 成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片断泳动度的增加是有差别 的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小，为了获得电泳分离DNA片 断的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm.电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以 低温为好，也可在室温下进行，在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃ 进行电泳。 6)染色观察：将电泳完成后的凝胶浸在含有溴化乙啶（浓度为0.5μg/mL ）的电泳缓冲液 中，染色约20min，在紫外灯（254nm或302nm波长）下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示 出红色的荧光条带。一般紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观 察时，应带上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受紫外光损伤。采用凝胶成像系 统拍摄电泳条谱。 五：问题讨论 1) 在细胞内质粒DNA是共价闭合环状DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果两条 链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛的分 子叫做开还DNA（ocDNA）；若两条链在同一处或其附近断裂则变成线性DNA分子。在 电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：cccDNA>直线 DNA>ocDNA，因此在本次试验中琼脂糖凝胶电泳上自制质粒呈现3条带。 2) 琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物，当熔化再凝固后就会形成固体基 质，其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量。带负电荷的核酸就可以在这种基质中， 在电场的作用下向阳极移动。核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数：1.DNA 的分子大小；2.琼脂糖的浓度；3.DNA的构象；4.所加电压；5.电场方向；6.碱基组 成与温度；7.嵌入的染料；8.电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影 响是：一定大小的DNA片断，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同；在一定浓度 的琼脂糖凝胶中，核酸片断的迁移率与其相对分子质量大小相反。 3) 溴化乙啶的化学名称是3,8-二氨基－5-乙基－6-苯基菲锭溴盐（简称EB或EtBr）， 由于溴化乙啶分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带呈现出桔 黄色的荧光，便于检测。EB能插入DNA分子中的碱基对之间，完成与DNA的结合。EB 染色具有以下特点：1.操作简便快速，室温下染色15min-20min；2.不会使核酸断 裂；3.灵敏度高，10ng或更少的DNA就可检出；4.可以加到样品中，随时用紫外追踪 检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配置和使用溴化乙啶的器皿或物 品，必须经特殊处理后再进行清洗或弃去。 4) 限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在 一对酶，即限制性内切酶和DNA甲基化酶。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生 物功能相反，前者是限制作用，后者是修饰作用。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它 能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，这就避免了限制性内切酶对细胞自 身DNA的切割破还。对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化就会被切割破还。 六：实验结果分析： 实验三 重组DNA分子的构建 一. 实验目的:了解DNA克隆技术的概念及其在分子生物学研究中重大意义,掌握DNA重组的方 法. 二. 实验原理