第六章食品中污染物、有害残留物含量的检测 实验一 食用油中黄曲霉毒素B的测定 一、目的要求 学习薄层层析法分离检测食用油黄曲霉毒素的实验方法，了解做好本实验的操作要点。 二、实验原理 样品中黄曲霉毒素B,经提取、浓缩、薄层分离后，在波长365mm紫外光下产生蓝紫色 荧光，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来测定含量。 三、仪器和试剂 (一)试剂 1、三氯甲烷。 2、甲醇。 3、苯。 4、乙腈。 5、硅胶G:海层色谱用 6、无水硫酸钠。 7、苯乙腈混合液：量取98mL苯，加2mL乙腈，混匀。 8、甲醇水溶液：55mL甲醇，加45mL水，混匀. 9、黄曲霉毒素B,标准溶液。 ()仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准 确称取25mg经干燥的重铬酸钾（基准级），用硫酸(0.5+1000)溶解后并准确稀释至200mL, 相当于[c(KzCr00.0004mol/L]。再吸取25mL此稀释液于50mL容最瓶中，加硫酸 (0.5+1000)稀释至刻度，相当于0.0002molL溶液。再吸取25mL此稀释液于50mL溶量 瓶中，加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度，相当于0.0001molL溶液。用1cm石英杯在最大吸收 峰的波长（接近350m处）用硫酸(0.5+1000)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸
第六章 食品中污染物、有害残留物含量的检测 实验一 食用油中黄曲霉毒素 B1的测定 一、目的要求 学习薄层层析法分离检测食用油黄曲霉毒素的实验方法，了解做好本实验的操作要点。 二、实验原理 样品中黄曲霉毒素 B1 经提取、浓缩、薄层分离后，在波长 365mm 紫外光下产生蓝紫色 荧光，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来测定含量。 三、仪器和试剂 （一）试剂 1、三氯甲烷。 2、甲醇。 3、苯。 4、乙腈。 5、硅胶 G：薄层色谱用。 6、无水硫酸钠。 7、苯乙腈混合液：量取 98mL 苯，加 2mL 乙腈，混匀。 8、甲醇水溶液：55mL 甲醇，加 45mL 水，混匀。 9、黄曲霉毒素 B1 标准溶液。 （1）仪器校正：测定重铬酸钾溶液的摩尔消光系数，以求出使用仪器的校正因素。准 确称取 25mg 经干燥的重铬酸钾（基准级），用硫酸（0.5+1000）溶解后并准确稀释至 200mL， 相当于[c(K2Cr2O7)=0.0004mol/L]。再吸取 25mL 此稀释液于 50mL 容量瓶中，加硫酸 （0.5+1000）稀释至刻度，相当于 0.0002mol/L 溶液。再吸取 25mL 此稀释液于 50mL 溶量 瓶中，加硫酸(0.5+1000)稀释至刻度，相当于 0.0001mol/L 溶液。用 1cm 石英杯在最大吸收 峰的波长(接近 350nm 处)用硫酸(0.5+1000)作空白，测得以上三种不同浓度的摩尔溶液的吸
光度，并按式)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。 式中E,一重铬酸钾溶液的摩尔消光系数： A—测得重铬酸钾溶液的吸光度； c一重铬酸钾溶液的摩尔浓度。 再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值3160比较，即求出使用仪器的校正因素， 按式(2)进行计算。 /=3160 E 式中 ∫一使用仪器的校正因素 E—测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。 若∫大于0.95或小于1.05，则所用仪器校正因素可略去不计。 (2)黄曲霉毒素B1标淮溶液的制备：准确称取1L.2mg黄曲霉毒素B1标淮品，先加 入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL,避光，置于4℃冰箱保存。该标准液约为10μgmL。 用紫外分光光度计测标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。 结果计算：黄曲霉毒素B,标准溶液的浓度计算按下式： X=4xMx1000×5 上3 式中X一黄曲霉毒素B1标准溶液的的浓度(gmL): A—测定的吸光值； ∫—所使用仪器的校正因素： M一黄曲霉毒素B1的分子量312： E2一黄曲毒素B,在苯-乙腈混合液中的摩尔消光系数19800， 根据计算，用苯一乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为10.0μgmL,并用分光光度计核 对其浓度
光度，并按式(1)计算出以上三种浓度的摩尔消光系数的平均值。 c A E1 = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (1) 式中 E1——重铬酸钾溶液的摩尔消光系数； A——测得重铬酸钾溶液的吸光度； c——重铬酸钾溶液的摩尔浓度。 再以此平均值与重铬酸钾的摩尔消光系数值 3160 比较，即求出使用仪器的校正因素， 按式（2）进行计算。 E f 3160 = - - - - - - - - - - - - - - - - - - - (2) 式中 f ——使用仪器的校正因素； E——测得的重铬酸钾摩尔消光系数平均值。 若 f 大于 0.95 或小于 1.05，则所用仪器校正因素可略去不计。 （2）黄曲霉毒素 B1 标准溶液的制备：准确称取 1~1.2 mg 黄曲霉毒素 B1 标准品，先加 入 2mL 乙腈溶解后，再用苯稀释至 100mL，避光,置于 4℃冰箱保存。该标准液约为 10μg/mL。 用紫外分光光度计测标准溶液的最大吸收峰的波长及该波长的吸光度值。 结果计算：黄曲霉毒素 B1 标准溶液的浓度计算按下式： 2 1000 E A M f X × × × = 式中 X——黄曲霉毒素 B1 标准溶液的的浓度（µg/mL）； A——测定的吸光值； f ——所使用仪器的校正因素； M——黄曲霉毒素 B1 的分子量 312； E2——黄曲霉毒素 B1 在苯–乙腈混合液中的摩尔消光系数 19800。 根据计算，用苯―乙腈混合液调到标准溶液浓度恰为 10.0μg/mL，并用分光光度计核 对其浓度
(3)黄曲霉毒素样纯度测定：取10μL/mL黄曲霉毒素标准溶液5μL,滴加于涂层厚 度0.25mm的硅胶G薄层板上，用甲醇-三氯甲烷(4+96)与丙桐-三氯甲烷(8+92)展开 剂展开，在紫外光灯下观察光的产生，应符合以下条件 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质的荧光点：原点上没有任何残留的荧光物质。 10、黄曲霉毒素B,标准使用液。 准确吸取1mL标准溶液(10μgmL)于10mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混 匀。此溶液每毫升相当于1.0μg黄曲霉毒素B1。吸取1.0mL此稀释液，置于5mL容量瓶中， 加苯-乙腈混合液至刻度，此溶液每毫升相当于0,2μg黄曲霉毒素B1。再吸取黄曲霉毒素 B,标准溶液(0.2μgmL)1.0mL置于5mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀释至刻度。此溶 液每毫升相当于0.04μg黄曲霉毒素B1。 (二)仪器 1、全玻璃浓缩器。 2、玻璃板：5cm×20cm。 3、展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。 4、紫外光灯：100W~125W,带有波长365nm滤光片。 5、微量注射器或血色素吸管 四、实验步骤 1、样品处理：称取油样4.00g置于小烧杯，用20mL正乙烷或石油醚将试样移于125ml 分液漏斗中。用20mL甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇2min,静置分 层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5mL甲醇水溶液重复振摇提取一次， 提取液并入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏中加入20mL三氯甲烷，振摇2min,静置 分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲 烷湿润的无水硫酸钠的定最慢速滤纸过滤于50mL燕发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏 斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗
（3）黄曲霉毒素样纯度测定：取 10μL/mL 黄曲霉毒素标准溶液 5μL，滴加于涂层厚 度 0.25mm 的硅胶 G 薄层板上，用甲醇–三氯甲烷（4+96）与丙酮–三氯甲烷（8+92）展开 剂展开，在紫外光灯下观察光的产生，应符合以下条件： 在展开后，只有单一的荧光点，无其他杂质的荧光点；原点上没有任何残留的荧光物质。 10、黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 准确吸取 1mL 标准溶液（10μg/mL）于 10mL 容量瓶中，加苯–乙腈混合液至刻度，混 匀。此溶液每毫升相当于 1.0μg 黄曲霉毒素 B1。吸取 1.0mL 此稀释液，置于 5mL 容量瓶中， 加苯–乙腈混合液至刻度，此溶液每毫升相当于 0.2μg 黄曲霉毒素 B1。再吸取黄曲霉毒素 B1 标准溶液（0.2μg/mL）1.0mL 置于 5mL 容量瓶中，加苯–乙腈混合液稀释至刻度。此溶 液每毫升相当于 0.04μg 黄曲霉毒素 B1。 （二）仪器 1、 全玻璃浓缩器。 2、 玻璃板：5cm×20cm。 3、 展开槽：内长 25cm、宽 6cm、高 4cm。 4、 紫外光灯：100W~125W，带有波长 365nm 滤光片。 5、 微量注射器或血色素吸管。 四、实验步骤 1、样品处理：称取油样 4.00g 置于小烧杯， 用 20mL 正乙烷或石油醚将试样移于 125mL 分液漏斗中。用 20m L 甲醇水溶液分次洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，振摇 2min，静置分 层后，将下层甲醇水溶液移入第二个分液漏斗中，再用 5m L 甲醇水溶液重复振摇提取一次， 提取液并入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏中加入 20m L 三氯甲烷，振摇 2min，静置 分层，如出现乳化现象可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约 10g 预先用三氯甲 烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于 50m L 蒸发皿中，再加 5m L 三氯甲烷于分液漏 斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗
液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却 2mim~3min后，准确加入1mL苯-乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后， 准确加入1mL苯-乙腈混合液)。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结品 析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，品体即消失，再用此滴管吸取上清液转移 于2mL具塞试管中。 2、单向展开法测定 (1)薄层板的制备：称取3g硅胶G,加相当于硅胶量2倍3倍左右的水，用力研磨 1min-2min至成糊状后立即倒入5cm×20cm玻璃板上，均匀铺占整块玻璃板。在空气中干 燥15min后，在100℃活化2h,取出，放于干燥器保存。一般可保存2~3天，若放置时间 较长，可再活化后使用。 (2)点样：将薄层板边缘附若的吸附剂刮净，在距薄层板下端3Cm的基线上，用微量 注射器均匀点4个样点，样点距边缘和点间距约为1cm,点直径约3mm。在同一块板上滴 加点的大小应一致，点样时可借助吹风机用冷风边吹边点。 各样点的样液成分如下： 第一点：10m黄曲霉毒素B1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：20叫待测样液。 第三点：20L待测样液+10L0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液 第四点：20L待测样液+104L0.2gmL黄曲霉青素B1标准使用液。 (3)展开：在展开槽内加10mL无水乙醚，预展12cm,取出挥干。再于另一展开槽内 10mL丙相-三氯甲烷(8+92)，展开10cm-12cm取出. (4)结果观察： 在365m紫外灯下观察样点结果。由于待测样液点上加滴黄曲霉毒素B1标准使用液， 可使黄曲霉毒素B,的标准点与样液中的黄曲霉毒素B,荧光点重叠。如待测样液为阴性，薄 层板上的第三点中黄曲霉毒素B,多0.0004g,可用作检查在样液内黄曲霉毒素B,最低检出
液并于蒸发皿中。将蒸发皿放在通风柜于 65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却 2min~3min 后，准确加入 1m L 苯–乙腈混合液（或将三氯甲烷用浓缩蒸馏器减压吹气蒸干后， 准确加入 1m L 苯–乙腈混合液）。用带橡皮头的滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶 析出，将蒸发皿从冰盒上取出，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移 于 2mL 具塞试管中。 2、单向展开法测定 （1）薄层板的制备：称取 3g 硅胶 G，加相当于硅胶量 2 倍~3 倍左右的水，用力研磨 1min~2min 至成糊状后立即倒入 5cm×20cm 玻璃板上，均匀铺占整块玻璃板。在空气中干 燥 15min 后，在 100℃活化 2h，取出，放于干燥器保存。一般可保存 2~3 天，若放置时间 较长，可再活化后使用。 （2）点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端 3cm 的基线上，用微量 注射器均匀点 4 个样点，样点距边缘和点间距约为 1cm，点直径约 3mm。在同一块板上滴 加点的大小应一致，点样时可借助吹风机用冷风边吹边点。 各样点的样液成分如下： 第一点：10µL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液（0.04µg/mL）。 第二点：20µL 待测样液。 第三点：20µL 待测样液+10µL 0.04µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 第四点：20µL 待测样液+10µL 0.2µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液。 （3）展开：在展开槽内加 10mL 无水乙醚，预展 12cm，取出挥干。再于另一展开槽内 10mL 丙酮–三氯甲烷（8+92），展开 10cm~12cm 取出。 （4）结果观察： 在 365nm 紫外灯下观察样点结果。由于待测样液点上加滴黄曲霉毒素 B1标准使用液， 可使黄曲霉毒素 B1 的标准点与样液中的黄曲霉毒素 B1 荧光点重叠。如待测样液为阴性，薄 层板上的第三点中黄曲霉毒素 B1 多 0.0004µg，可用作检查在样液内黄曲霉毒素 B1 最低检出
量是否正常出现：如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1为0.002g 主要起定位作用， (5)确正实验：若第二点在与黄曲霉青素B标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表 示试样中黄曲霉毒素B,含量在5gkg以下：如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确 证试验。具体操作如下： 为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B,产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉 毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在0.1左右。于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点：0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液10-叫L。 第二点：204样液。 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min后， 使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：0.04gmL黄曲霉毒素B1标准使用液10mL。 第四点：20L样液。 再按上法展开后，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素B标准点相同的衍 生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 (6)稀释定量：样液中的黄曲霉毒素B荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素B标准点 的最低检出量(0.0004g)的荧光强度一致，则试样中黄曲霉毒素B1含量即为5gkg。如样 液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不 同微升数，直到样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：10mL黄曲需毒素B1标准使用液(0.04gmL)。 第二点：根据情况滴加10L样液。 第三点：根据情况滴加15L样液。 第四点：根据情况滴加20μL样液。 五、结果计算：
量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素 B1 为 0.002µg， 主要起定位作用。 （5）确正实验：若第二点在与黄曲霉毒素 B1 标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表 示试样中黄曲霉毒素 B1含量在 5µg/kg 以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确 证试验。具体操作如下： 为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素 B1产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉 毒素 B1 的衍生物，展开后此衍生物的比移值约在 0.1 左右。于薄层板左边依次滴加两个点。 第一点：0.04µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液 10µL。 第二点：20µL 样液。 于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应 5min 后，用吹风机吹热风 2min 后， 使热风吹到薄层板上的温度不高于 40℃，再于薄层板上滴加以下两点。 第三点：0.04µg/mL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液 10µL。 第四点：20µL 样液。 再按上法展开后，在紫外光灯下观察样液是否产生与黄曲霉毒素 B1 标准点相同的衍 生物。未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的衍生物空白对照。 （6）稀释定量：样液中的黄曲霉毒素 B1 荧光点的荧光强度如与黄曲霉毒素 B1 标准点 的最低检出量（0.0004µg）的荧光强度一致,则试样中黄曲霉毒素 B1 含量即为 5µg/kg。如样 液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少滴加微升数或将样液稀释后再滴加不 同微升数，直到样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。滴加式样如下： 第一点：10µL 黄曲霉毒素 B1 标准使用液（0.04µg/mL）。 第二点：根据情况滴加 10µL 样液。 第三点：根据情况滴加 1５µL 样液。 第四点：根据情况滴加 20µL 样液。 五、结果计算：