第20卷第3期 作物学报 Vol. 20, No. 3 1994年5月 ACTA AGRONOMICA SINICA May,1994 研究 简报 小麦培养细胞与燕麦叶肉细胞 原生质体的电融合 吴琴生刘大钧 (南京农业大学细胞遗传研究室,江苏南京21005) Electrofusion of Wheat Cell Culture Protoplasts and Oct Mesophyll Protoplasts Liu Da-jun togenetus I alo atory. un jmg Agricultural University, Nanjing 210095) 燕麦( Avena sativa L.)具有许多农业上重要的性状。但小麦和燕麦分类上属不同族,亲缘 关系较远,有性杂交十分困难。近年来,在双子叶模式植物上建立的只转移供体亲本部分遗传 物质的原生质体不对称融合技术为将燕麦有益性状导入小麦提供了可能。实现体细胞杂种定 向不对称的途径有两种:是利用细胞周期停滞在间期的叶肉细胞原生质体为供体亲本与作 为受体亲本的培养细胞原生质体融合由于二者分裂速度的差异,使前者染色体大量片段化 ( fragmentation)而被消除( Bravo et al.,1985; Dudits et al.,1988);再是利用高于致死剂量的 电离射线处理供体亲本原生质体使其遗传物质大量消除后再与受体融合( Gleba et al 1990)。有关第一种途径在禾谷类植物上应用的可能性尚未见有研究报道。本文报道我们利用 这一途径进行小麦和燕麦族间原生质体融合的实验结果 1材料和方法 1.1植物材料小麦细胞悬浮系HINF由品种 Maris huntsman幼穗胚性愈伤组织建立 保持于MS附加2,4Dlmg/L的液体培养基中,每周继代一次。燕麦基因型为“察化燕麦”。 1.2原生质体的制备和失活取继代后4-5天(线性生长期)的小麦培养细胞2毫升与 毫升含 cellulase r-101%, pectolyase Y230.05%,KHPO494毫克/升,CaCl2·2HO 1029mg/L,MES600mg/L,甘露醇0.55mol/L,pH5.7的酶液混合后,在28C慢速摇床 (40rpm)上作用3-4小时。酶解产物经400目尼龙网过滤后,200rpm离心5分钟收集原生质 体。然后用不同浓度(0-3mmol/L)碘乙酰胺(IOA)处理,室温(23-25℃)下作用20分钟。原 生质体用融合液(含0.55mol/L甘露醇、0.5mmol/ L CaCl2·2H2O的重蒸水溶液)漂洗3次, 密度调至3×105/ml燕麦种子在26-27℃、光强400oLux,16hor./day的条件下萌发。取生长 10-12天幼苗第一片叶基部4cm作为分离原生质体的材料。叶片表面消毒后,横切成约1mm 的小段,按1g叶片/10ml酶液的比例加入酶液。酶液组成除将 Cellulase r-10浓度提高至 1.5%外余者同小麦。在28C下静止4小时后,用400目尼龙网过滤,100rpm离心10分钟收集 原生质体。然后用融合液洗3次,密度调至3×105/ml。 现在通讯地址;东北师范大学遗传与细胞研究所长春130024 本文于1992年10月15日收到,1993年3月28日终审完毕。 201994-2008ChinaAcademieJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
第 卷 第 期 年 月 作 物 学 报 , , 网 小麦培养细胞与燕麦叶肉细胞 原生质体的电融合 刘 保 ‘ 吴琴 生 刘大钧 南京农 业大学细 胞遗传研 究室 , 江苏南京 一 , ￡。 ‘ 必阮片以 , , 明娜 汉以 “ 以 冶 一 拟 , 朗户 燕麦 具有许多农业上重要 的性状 。 但小麦和燕麦分类上属 不 同族 , 亲缘 关 系较远 , 有性杂交十分 困难 。 近年来 , 在双子 叶模式植物上建立 的只转移供体亲本部分遗传 物质的原生质体不对称融 合技木 为将燕麦有益性状导 入 小麦提供 了可能 。 实现体细胞杂种定 向不对 称 的途径 有两种 一 是 利用细胞周 期停 滞在 间期 的 叶 肉细 胞 原生质体为供体亲本 与作 为 受体亲本的培 养细 胞 原 生质体 融合 , 由于 二 者分裂 速 度 的差 异 , 使前者 染色 体大量 片段化 而被消除 , , 再是 利用高 于致 死剂量的 电 离 射 线 处理 供 体 亲 本 原 生 质 体 , 使 其 遗 传物 质 大 量 消 除 后 再 与 受 体融 合 , 。 有关第一种途径在禾谷类植物上应用的可能性 尚未 见有研究报道 。 本文报道我 们利用 这一途径进行小麦和燕 麦族 间原 生质体融合的实验结果 。 材 料 和 方 法 植 物材料 小麦 细胞悬 浮系 由品种 幼穗胚性 愈伤组 织建立 , 保持于 附加 , 一 的液体培养 基 中 , 每周继 代一次 。 燕麦基 因型为 “ 察化燕麦 ” 。 原生质体的制 备和失活 取继 代后 一 天 线性 生 长期 的小 麦培 养 细 胞 毫 升 与 毫 升 含 一 一 , , 毫 克 升 , · , , 甘 露 醇 , 的 酶 液 混 合 后 , 在 ℃慢 速 摇 床 上作用 一 小 时 。 酶解 产物经 目尼 龙 网过滤后 , 离心 分钟收集原 生质 体 。 然后 用不 同浓度 一 碘 乙 酞胺 处理 , 室温 一 ℃ 下作用 分钟 。 原 生 质体用融合液 含 甘露醇 、 · 的重 蒸水溶 液 漂洗 次 , 密度调至 又 。 燕 麦种子在 一 ℃ 、 光强 , 的条件下萌发 。 取 生长 一 天幼苗第一 片叶基部 作为分离原生质体的材料 。 叶片表面消毒后 , 横切成约 的 小 段 , 按 叶 片 酶液 的 比例加 入酶液 。 酶液 组 成 除将 一 浓 度提 高 至 外余者 同小麦 。 在 ℃下静止 小时后 , 用 。 目尼龙 网过滤 , 印 离心 分钟 收集 原生质体 。 然后用 融合液洗 次 , 密度调至 丫 。 现 在通 讯地址 东北 师 范 大学遗 传 与细 胞研究所 , 长春 · 本 文于 年 月 日收到 , 年 月 日终审 完 毕
期 刘保等:小麦培养细胞与燕麦叶肉细胞原生质体的电融 1.3原生质体融合及培养实验采用本室研制的“南农CY-2型细胞融合仪”。融合在两片 1毫米厚的铜片作为电极粘合于载玻片上组成的宽15mm,容积约1004的小室中进行。将双 亲原生质体1:1混合后加入。先施加交流电场再给予瞬间直流方波脉冲,之后交流电场衰减为 零。在倒置显微镜下观察全过程,确定适宜电场参数,融合产物转到平铺在含有看护细胞 (HⅠNF培养细胞)的琼脂糖培养基上的孔径0.8m的微孔滤膜上,再加入等量浓度2倍的 MS培养基(葡萄糖浓度为单倍),培养于27℃、黑暗条件下。培养基组成为:MS附加2,4D 1mg/L,NAA0.5mg/L,KT0.2mg/L,水解酪蛋白CH)200mg/L,谷氨酰胺3mg/L,天冬氨 酸150mg/L,蔗糖10g/L及葡萄糖0.5mol/,pH56抽滤灭菌。塔养过中每天取样观察融 合细胞的变化。并将培养物于冰水(0C)中预处理24小,用改良卡宝品红染色压片观察染色 体。每2一3周将滤膜转至新鲜培养基上,并降低或去掉其中的葡萄糖 2站果和讨论 2.1小麦培养细胞原生质体的失活小麦培养细胞原生质体对IOA处理十分敏感。培养 后2天观察结果表明,经0.5mmo/L处理的原生质体约有20%左右褐变且皱缩,质膜不完 整,初步认为这种原生质体已死亡。当IOA浓度达1.5 m mol/L时,几乎所有原生质体均死亡 (表1)。培养1周时的观察结果证实了以上的推测;在1.5mmol/L处理中没有找到分裂细胞, 而对照中分裂细胞可达20%以上。可见,IOA浓度为1.5mmol/L时可作为小麦HINF培养细 胞原生质体的致死浓度。在融合实验中,我们则采用20-2.5mmol/LDOA处理,以确保没有 存活的小麦原生质体。 变1IOA处理对HINF原生质体存活率和植板率的影响 Table 1 Erfects of IOA on Protoplast Viabuity and Plating effciency OA浓度(mM)原生质体存活率分裂细胞频率(%)IOA浓度(mM)原生质体存活率分裂细胞频率(% IOA concentration (%)% of viable %of dividing IOA concentration(%)% of viable of dividing 原生质体培养于以HNF为看护细胞的微孔滤膜上 inoculated on nitrocellulose filters nursed by hinf suspension cells 22小麦培养细胞与燕麦叶肉细胞原生质体电融合过程及适宜电场条件100y原生质体 混合液的电融合可在1分钟内完成。在交流场强≥100/m,频率0.5-1.0兆赫兹条件下 90%以上的原生质体在10秒内排列成串(图1),长度一般为10-20个原生质体(图版I)。然 后给予幅宽为40sec.,场强1500-2000V/cm一次直流方波脉冲,40-50%的原生质体立即 融合。对5个电场参数的研究发现,对融合频率尤其是对一对一异质融合频率影响最大的是交 流场强和直流脉冲场强。对于交流电场,在小于200V/cm的范围内,随场强增加,原生质体融 合总频率随之提高,但一对一异质融合频率以100V/cm时最高,之后开始平缓下降。这种趋势 在施加直流脉冲后更为明显;当直流脉冲场强为2000V/cm时,一对一异质融合频率最高 (10%左右),之后迅速降低,而融合总频率则不断上升(图2)。场强增加,一对一异质融合频率 下降的原因可能是:增加场强一方面使已融合的原生质体进一步融合;另一方面使未融合原生 质体与已融合原生质体融合;却难以使未融合原生质体彼此间融合。因为易融合性与融合颗粒 201994-2008ChinaAcademicjOurnalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net
期 刘 保等 小麦培养细胞与燕麦叶肉细胞原生 质体的电融合 原生质体触合及培养 实验 采用本室研制 的 “ 南农 一 型细胞融合仪 ” 。 融合在两 片 毫米厚的铜 片作为 电极粘 合于载玻片上组成 的宽 , 容积约 即 的小室 中进行 。 将双 亲原 生质体 混合后加入 。 先施 加交流 电场再给予瞬 间直流方波脉 冲 , 之后交 流 电场衰减 为 零 。 在倒 置 显 微镜 下 观 察 全 过 程 , 确 定适 宜 电场参数 , 融 合 产 物转 到 平铺在 含 有看 护 细 胞 培 养细胞 的琼 脂糖培 养基上 的孔径 拜 的 微 孔滤 膜 上 , 再 加 入等 量浓 度 倍 的 培 养基 葡萄糖 浓 度为 单 倍 , 培 养于 ℃ 、 黑 暗条 件下 。 培 养基 组成 为 附 加 , 一 , , , 水解酪蛋 白 , 谷氨酞胺 , 天冬氨 酸 , 蔗糖 鲍 及葡萄糖 争 , , 抽滤灭菌 。 培 养过程 中每天取样 观察融 合细胞的变化 。 并将培 养物 于冰水 ℃ 中预处理 小时 , 用改 良卡宝 品红 染色 压 片观察染 色 体 。 每 一 周将滤 膜转 至 新鲜培养基上 , 并 降低或 去掉其 中的葡萄糖 。 结 果 和 讨 论 小麦培养细胞原生质体 的失活 小麦培养细胞 原生 质体 对 处理十分敏感 。 培 养 后 天 观 察结果表 明 , 经 。 处理 的原 生 质 体约 有 左 右 褐变 且 皱 缩 , 质 膜不 完 整 , 初步认为这种原 生质体 已 死亡 。 当 浓 度达 时 , 几 乎所有原生质体均死 亡 表 。 培养 周时 的观察结果证实 了以 上 的推测 在 处理 中没有找到 分裂细 胞 , 而对照 中分裂细胞可达 以上 。 可见 , 浓度为 时可作为小麦 培养细 胞原 生质体的致死浓度 。 在融合实验 中 , 我们则 采用 。一 处理 , 以确保没有 存活 的小麦原生质体 。 衰 处理对 俐 原生质体存活率和植板率的影晌 · 伙 丫 吐 臼比衍 触 浓 度 功 〕 原 生质体 存活 率 分裂细胞频率 浓 度 原 生 质体存活 率 分裂 细 胞频率 叭 比 , 原生质体培 养于 以 为看护 细 胞的徽孔建 膜上 。 圣 叶 小麦培养细胞与燕麦叶 肉细胞原生质体电融合过程及适宜电场条件 川 原生质体 混合液 的 电融合可在 分钟 内完成 。 在交 流场 强 , 频 率 。 一 兆 赫兹条件下 , 以上的原生质体在 秒 内排列成 串 图 , 长度一般 为 一 个原生质体 图版 。 然 后给予 幅宽 为 娜 , 场强 一 一次直流方波脉 冲 , 一 的原生质体立 即 融合 。 对 个 电场参数的研 究发现 , 对融合频率尤其是对 一对一异质融合频率影 响最大的是交 流场强和直流脉冲场强 。 对 于交流 电场 , 在 小于 的范围内 , 随场强增 加 , 原生质体融 合总频率随之提高 , 但一对 一异 质融合频率 以 时最 高 , 之后开 始平缓下降 。 这种趋势 在施 加 直 流脉 冲后 更 为 明显 当直 流 脉 冲场 强 为 时 , 一 对 一 异 质 融 合频 率 最 高 左右 , 之后迅速 降低 , 而融合总频率则不断上 升 图 。 场 强增加 , 一对 一异 质融合频率 下降的原 因可能是 增 加场 强 一方面使 已融合的原生质体进一步 融合 另一方 面使未融合原 生 质体与 已融 合原生质体 融合 却难以使未融合原生 质体彼此 间融 合 。 因为易融合性 与融合颗粒
372 作 20卷 大小成正比例。其它三个电场参数对一对一异质融合影响不大。但考虑到对原生质体活力的 可能不利影响,应尽可能选取较低的值。初步实验表明,当交流频率0.5-1.0兆赫兹,直流脉 冲幅宽为40μsec.,脉冲1次时对小麦培养细胞原生质体的活力和植板率无任何不利影响(数 据未给出) 成串原生质体频率 对一异质融合原生质体频率 融合原生质体总频率 图1交流电场强度对小麦培养细胞和燕麦叶肉 图2直流脉冲场强对小麦培养细胞 细胞原生质体成串和融合的影响 和燕麦叶肉细胞原生质体融合的影响 ig. 1 Effects of AC field strength on wheat cell cultur ig 2 Effects of DC field strength on wheat cell protoplasts and oat mesophyll protoplasts aligning and fus- culture protoplast and oat mesophyll protoplasts ion (AC frequency 0. 5 Mhz; DC 1500V/cm. 40us, once) fusion (AC, 100V/cm, 0. 5MHz; DC, 40 us 2.3融合细胞分裂形成细胞团由于融合前小麦原生质体经高于致死浓度的IOA处理 而在本文实验中采用的MS培养基和培养方式上燕麦叶肉原生质体不能够复壁和分裂(待发 表结果),所以能够复壁并分裂的细胞即为融合细胞。此外,从形态上融合细胞也很容易鉴别 (图版2,4)。融合后培养24小时,观察到了核融合现象(图版3);4天时观察到了复壁的融合 细胞(图版5);1周时观察到典型、对称的细胞一次分裂(图版6);10天出现2-3次分裂(图版 7)。这时细胞学观察注意到许多处于分裂中期的杂种细胞特定区域染色体片段化现象(图版 8)。由于IOA无任何诱变作用( Gleba et al.,1990),而且在作为对照的小麦原生质体培养中从 未观察到这种现象,可推知片段化的染色体可能为燕麦。产生这种现象的原因,一般认为是由 于叶肉细胞与培养细胞融合后,杂种细胞的分裂速度主要由迅速分裂的培养细胞决定( Bravo etal.,1985)。分裂上的不同步会引起叶肉细胞染色体提前集缩[ premature chromosome con- densation(PCC)],而使之片段化( fragmentation)。继续培养叶绿体逐渐解体消失,细胞继续分 裂,但愈加不正常(图版9,10),培养6周时可观察到大量由多细胞构成的不规则的细胞团,这 时叶绿体已消失贻尽(图版11)。这些细胞团在一系列培养基上无一继续分裂形成愈伤组织 本文实验首次观察到处于分裂间期的燕麦叶肉细胞能够与代谢上被IOA抑制的小麦培 养细胞相互补偿,融合细胞能够恢复活力进行复壁和分裂。低后期的分裂趋于异常,致使细胞 团停止发育。有关原因尚不清楚,需要进一步研究。 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net
作 物 学 报 卷 大小成正 比例 。 其它三个 电场参数对一对一异质融合 影响不大 。 但考虑到对原生质体 活力 的 可能不 利影 响 , 应 尽可能选取较低 的值 。 初步实验表 明 , 当交流频率 一 兆赫兹 , 直流脉 冲幅宽为 拌 , 脉 冲 次时对 小麦培养细胞 原 生质体的 活力和 植板率无任何 不利 影 响 数 据未给出 。 产一 ’ ’ 一 , , 仁」 户 成 申原 生质体 孩 率 触合 原 生质 体 总橄 率 一 尸 丫团 欲︶︵ 黝巧 一 令 一 一 对 一异 质 合原 生 质体 倾 率 才了 印 卜卜 荞洲︵ 卜 吮 , 一 一 卜 一卜 一 , 交流 电场 强度 图 交流 电场强 度对 小麦 培 养细 胞和 燕 麦叶 肉 细 胞 原生质体成 串和 融 合的影 响 一 巨 泌 旧 王 叹 , 哪 , 直流 脉 冲 场 强嘴 ‘ 图 直流脉冲场强 对小麦培 养细 胞 和燕 麦叶肉细胞原生质体融合的影 响 二 己 眺 , , , 娜 , 融合细胞分裂形成细胞团 由于 融 合前 小 麦原 生质体 经高于致死浓度的 处 理 , 而 在本文实验 中采用的 培 养基和培 养方式上燕 麦 叶 肉原生 质体不能够复壁和分 裂 待发 表 结果 , 所 以能够复壁 并分裂 的细胞 即 为融合细胞 。 此 外 , 从形 态上 融合细 胞也很容 易鉴别 图版 , 。 融 合后培养 小时 , 观察到 了核融 合现象 图版 天 时观察到 了复 壁 的融合 细胞 图版 周 时观察到典型 、 对称的细胞一次分裂 图版 天出现 一 次分裂 图版 。 这时细 胞学观察注意到 许 多处于分 裂 中期 的杂种细 胞特 定 区域染色体 片段化现象 图版 。 由于 无任何诱变作 用 , , 而且在作 为对照 的小 麦原 生质体培养 中从 未观察到这 种现象 , 可推 知 片段化的染色体可能为燕麦 。 产生这种现象 的原 因 , 一般认为是 由 于 叶 肉细胞与培养 细胞 融 合后 , 杂种细 胞 的分裂速度 主要 由迅速 分裂的培 养细胞决定 。 , 。 分裂上 的不 同步会 引起 叶 肉细胞染 色体提前集缩 〔 。 , 而使之 片段 化 。 继续培养 叶绿体逐渐解体 消失 , 细 胞继续分 裂 , 但愈加不正 常 图版 , , 培 养 周时可观察到大量 由多 细胞构成的不规则 的细胞 团 , 这 时 叶绿体 已 消失 贻尽 图版 。 这些细 胞团在 一 系列培养基 上无一继续分裂形 成愈伤 组织 。 本文实验 首次 观察 到处 于分裂 间期的燕麦 叶 肉细 胞能够 与代谢上被 抑制 的小麦培 养细 胞相互补偿 , 融合细 胞能够恢复活 力 , 进行复 壁和 分裂 。 但后期的分裂趋于 异常 , 致使细胞 团停 止发 育 。 有关原 因 尚不清楚 , 需要进 一步研究
刘保等:小麦培养细胞与燕麦叶肉细胞原生质体的电融合 图版I Liu Bao et al. Electrofusion of Wheat Cell Culture Protoplasts and Oat Mesophyll Protoplasts Plate I 2 4 5 ⊙6 7 1.小麦培养细胞原生质体与燕麦叶肉细胞原生质体在交流电场中排列成串(部分)2.一对一异质融合体(直流脉冲后 2分钟)3.改良卡宝品红染色示核融合4.一对一异质融合细胞及其双亲(培养后2天),小麦原生质体因1OA而失 活、褐变、皱缩5.融合细胞再生细胞壁6.融合细胞典型一次分裂7.融合细胞23次分裂8.培养2周的 融合细胞,箭头示燕麦染色体片段化9.继续分裂的融合细胞10.由多细胞构成的杂种细胞团。1.培养6周的杂 种细胞团停止发育。 Explanations of plates 1. Protoplasts of wheat cultured cells and oat mesophyll cells alighed at AC field 2. Binary hetero-fused c ell 2 min after DC pulse 3. Modified fuchsin staining showing fusion of the nuclei 4. Binary hetero-fused cell and its parents, noting the wheat parent was inactivated by 10A 5. Hybrid cell regenerated new cell ell 7. Second to third division of hybrid cell me fragmentation in a hybrid cell, arrowed 9. Sustained division of hybrid cell 10. Multicellular hy brid colony 11. Hybrid colony stopped developing g1994-2008ChinaAcademicJournalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp://www.cnki.net