D0I:10.13374/i.i8sm1001063.2010.11.006 第32卷第11期 北京科技大学学报 Vol 32 No 11 2010年11月 Journal of Un iversity of Science and Technology Beijing Nov 2010 降解高含盐溴氨酸菌种的选育与鉴定 林海)程琳)胡琼) 1)北京科技大学土木与环境工程学院，北京1000832)冶金工业规刘研究院，北京100711 摘要从生物接触氧化池的生物膜中筛选分离出10株在高盐条件下对蒽醌染料中间体溴氨酸有降解脱色作用的菌株.通 过对lO株菌株的逐级驯化复筛，得到一株脱色效果好且脱色能力稳定的菌株C一7，经鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundil).菌株C一7的耐盐性试验结果表明，盐的质量分数为1%~%时，对菌株的生长和脱色没有影响，脱色率为80%以 上：盐的质量分数为%时，菌株C一7也具有较高的耐受力，脱色率可达到50%以上：盐的质量分数为1%时，对菌株的生长 产生抑制作用，不能降解溴氨酸.菌株最适生长条件为：蛋白胨7gL,H7.0摇床转速160~mn,250mL摇瓶中装液量 120mL接种量10%，在此条件下，在盐的质量分数为1%、蛋白胨为唯一氨源的培养基中，溴氨酸(100mgL1)的脱色率可达 859%以上· 关键词废水处理；溴氨酸：菌种：生物降解 分类号X703.1 Breeding and identification of bacteria for high-salt brom am ine acid LN Ha,CHENG Lin,HU Q iong) 1)School ofCivil and Envimommental Engineering University of Science and Technolgy Beijing Beijing 100083 China 2)China Metallrgical Industry Planning and Research Institte Beijing 100711.China ABSTRACT 10 strains capable of degmading and decolorizing brmamn ine acil under high salt conditions which is an intemediate of anthraquinone dye were isolated from the biomemnbrane of a bio"contact oxdation tank A strain named C-7 which has good decolori zing effect and stable decolorization ability was obtained by acclmating the 10 strains It was identified as Citrobacter freundil Salt to erance test results show that the strain C-7 can grow with a decolorization rate ofmore than 80%when the mass fraction of NaCl is 1% to 3,and NaCl has no effect on the grow th and decoborization of the stran W hen the mass fraction of Nacl is 7%.C-7 show high tolerance and the decolorization rate is more than 50.NaCl can inhibit the grow th of the stran C-7 and bmman ine acid cannot be de- graded when the mass fraction increases to 10.Under the optional gmw th conditions of pH 7.0 the rotating rate of 160min,the liquid volme of 120mL in a 250mL flask inocula of10 and peptone of7gL as the only nitrogen source when the mass fraction of NaCl is 1%,the decolorization rate of bromna ine acid (100mgL)can reach to 85%or higher KEY WORDS wastewater treament bromam ine acid bacteria biodegradation 染料、化工、食品、纺织和制药等行业在生产过 溴氨酸（学名为1一氨基一4一溴蒽醌一2一磺 程中产生大量的含盐工业废水，除含有高浓度的盐 酸，简称ABA)是蒽醌染料中间体中的一种，主要用 外，还含有大量的有毒难降解溶解性有机物，如苯环 于合成蒽醌染料，是一种重要的蒽醌染料中间体，广 类化合物和烃类等，特别是蒽醌类物质，其属于 泛存在于印染、纺织等生产废水中，该废水具有高 芳香族化合物，有稳定的共轭结构，结构复杂，难以 COD值、高色度、高盐度等特点，难以被普通微生物 降解，存在潜在毒性，不易被氧化，可生化性差，这些 降解，因此其生物降解受到广泛重视3-). 给废水处理带来一定难度]. 本研究通过菌种的筛选、降解能力和耐盐性的 收稿日期：2009-12-25 作者简介：林海(l966一)，男，教授，博士生导师，Email linhaf色ces ust山ed:cm
第 32卷 第 11期 2010年 11月 北 京 科 技 大 学 学 报 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｅｉｊｉｎｇ Ｖｏｌ．32Ｎｏ．11 Ｎｏｖ．2010 降解高含盐溴氨酸菌种的选育与鉴定 林 海 1） 程 琳 2） 胡 琼 1） 1） 北京科技大学土木与环境工程学院北京 100083 2） 冶金工业规划研究院北京 100711 摘 要 从生物接触氧化池的生物膜中筛选分离出 10株在高盐条件下对蒽醌染料中间体溴氨酸有降解脱色作用的菌株．通 过对 10株菌株的逐级驯化复筛得到一株脱色效果好且脱色能力稳定的菌株 Ｃ－7经鉴定为弗氏柠檬酸杆菌 （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｌ）．菌株 Ｃ－7的耐盐性试验结果表明盐的质量分数为 1％ ～3％时对菌株的生长和脱色没有影响脱色率为 80％以 上；盐的质量分数为 7％时菌株 Ｃ－7也具有较高的耐受力脱色率可达到 50％以上；盐的质量分数为 10％时对菌株的生长 产生抑制作用不能降解溴氨酸．菌株最适生长条件为：蛋白胨 7ｇ·Ｌ －1ｐＨ7∙0摇床转速 160ｒ·ｍｉｎ －1250ｍＬ摇瓶中装液量 120ｍＬ接种量 10％在此条件下在盐的质量分数为 1％、蛋白胨为唯一氮源的培养基中溴氨酸 （100ｍｇ·Ｌ －1 ）的脱色率可达 85％以上． 关键词 废水处理；溴氨酸；菌种；生物降解 分类号 Ｘ703∙1 Ｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｆｏｒｈｉｇｈ－ｓａｌｔｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄ ＬＩＮＨａｉ 1）ＣＨＥＮＧＬｉｎ 2）ＨＵＱｉｏｎｇ 1） 1） ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｉｖｉｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｅｉｊｉｎｇＢｅｉｊｉｎｇ100083Ｃｈｉｎａ 2） ＣｈｉｎａＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙＰｌａｎｎｉｎｇａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅＢｅｉｊｉｎｇ100711Ｃｈｉｎａ ＡＢＳＴＲＡＣＴ 10ｓｔｒａｉｎｓｃａｐａｂｌｅｏｆｄｅｇｒａｄｉｎｇａｎｄｄｅｃｏｌｏｒｉｚｉｎｇｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄｕｎｄｅｒｈｉｇｈｓａｌｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｈｉｃｈｉｓａｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｏｆａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｄｙｅｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｏｆａｂｉｏ-ｃｏｎｔａｃｔｏｘｉｄａｔｉｏｎｔａｎｋ．ＡｓｔｒａｉｎｎａｍｅｄＣ-7ｗｈｉｃｈｈａｓｇｏｏｄｄｅｃｏｌｏｒｉ- ｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔａｎｄｓｔａｂｌｅｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙａｃｃｌｉｍａｔｉｎｇｔｈｅ10ｓｔｒａｉｎｓ．ＩｔｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｌ．Ｓａｌｔｔｏｌ- ｅｒａｎｃｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎＣ-7ｃａｎｇｒｏｗｗｉｔｈａｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｍｏｒｅｔｈａｎ80％ ｗｈｅｎｔｈｅｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＮａＣｌｉｓ1％ ｔｏ3％ａｎｄＮａＣｌｈａｓｎｏｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎ．ＷｈｅｎｔｈｅｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｆＮａＣｌｉｓ7％Ｃ-7ｓｈｏｗｈｉｇｈ ｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｔｈｅｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｉｓｍｏｒｅｔｈａｎ50％．ＮａＣｌｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＣ-7ａｎｄｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄｃａｎｎｏｔｂｅｄｅ- ｇｒａｄｅｄｗｈｅｎｔｈｅｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｏ10％．ＵｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｏｎａｌｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｐＨ7∙0ｔｈｅｒｏｔａｔｉｎｇｒａｔｅｏｆ160ｒ·ｍｉｎ －1ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄｖｏｌｕｍｅｏｆ120ｍＬｉｎａ250ｍＬｆｌａｓｋｉｎｏｃｕｌａｏｆ10％ ａｎｄｐｅｐｔｏｎｅｏｆ7ｇ·Ｌ －1ａｓｔｈｅｏｎｌｙｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｗｈｅｎｔｈｅｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆＮａＣｌｉｓ1％ｔｈｅｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄ（100ｍｇ·Ｌ －1 ） ｃａｎｒｅａｃｈｔｏ85％ ｏｒｈｉｇｈｅｒ． ＫＥＹＷＯＲＤＳ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄ；ｂａｃｔｅｒｉａ；ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ 收稿日期：2009－12－25 作者简介：林 海 （1966－ ）男教授博士生导师Ｅ-ｍａｉｌ：ｌｉｎｈａｉ＠ｃｅｓ．ｕｓｔｂ．ｅｄｕ．ｃｎ 染料、化工、食品、纺织和制药等行业在生产过 程中产生大量的含盐工业废水除含有高浓度的盐 外还含有大量的有毒难降解溶解性有机物如苯环 类化合物和烃类等 ［1］特别是蒽醌类物质其属于 芳香族化合物有稳定的共轭结构结构复杂难以 降解存在潜在毒性不易被氧化可生化性差这些 给废水处理带来一定难度 ［2］． 溴氨酸 （学名为 1－氨基 －4－溴蒽醌 －2－磺 酸简称 ＡＢＡ）是蒽醌染料中间体中的一种主要用 于合成蒽醌染料是一种重要的蒽醌染料中间体广 泛存在于印染、纺织等生产废水中该废水具有高 ＣＯＤ值、高色度、高盐度等特点难以被普通微生物 降解因此其生物降解受到广泛重视 ［3－7］． 本研究通过菌种的筛选、降解能力和耐盐性的 DOI :10．13374／j．issn1001－053x．2010．11．005
第11期 林海等：降解高含盐溴氨酸菌种的选育与鉴定 .1401. 梯度驯化，从某化工污水处理站生物接触氧化池的 (2)菌株耐盐性研究，在溴氨酸的质量浓度为 生物膜中得到一株在高盐条件下对溴氨酸有较高降 100mgL的无机盐驯化培养基中，对最优菌株进 解脱色能力的菌株，并对影响该菌株降解溴氨酸的 行耐盐性研究，同样为逐级连续传代驯化法，盐的质 因素进行了分析，最后对筛选得到的菌株进行了鉴 量浓度为10gL、30gL、70gL和100gL. 定以及16SDNA的序列分析. (3)脱色菌氨源及其他特性研究，通过单因素 试验，对菌株的最佳脱色培养基的氨源种类和用量 1材料与方法 以及各影响因素进行研究，在溴氨酸的质量浓度为 1.1试剂及培养基 100mgL、NaC1为10gL的培养基中，规定条 (1)试剂，溴氨酸购自金坛市威德龙化学有限 件：氮源，培养基初始H7,摇床转速130min, 公司，外观为橘红色粉状物，溶于水，其质量分数为 250mL摇瓶中装液量100mL接种量10%.试验时 95%以上，其余试剂为市售分析纯. 间为40h试验过程中，改变一个参数，固定其他条 (2)培养基. 件，进而确定菌株的最佳生长与降解条件， 富集培养基：牛肉膏5000mg·L,蛋白胨 (4)菌种鉴定，通过Biolog和分子生物学方法 10000mgL,NaC110000mgL,pH7.2~8.0 对菌株进行鉴定， 蒸馏水1000mL 1.3分析方法 选择性培养基：溴氨酸200mgL,(NH4)2S04 生物量：在溴氨酸降解脱色试验过程中定时取 2000 mg L.K2 HPO,1 400 mg L,KH2 PO 样，测定ODoo值，表征生物量 600mg L,MgsO 100 mg L,CaCk 100mgL. 脱色率：取不同时间的培养物4mL在6000 NaC110000mgL,琼脂18000mgL,H7.2~ min的转速下离心30min以去离子水为空白， 8.0 于溴氨酸的最大吸收波长(485mm)处测其吸光度， 种子培养基：牛肉膏5000mg·L,蛋白陈 其值反映培养基中溴氨酸的质量浓度， 10000mgL,pH7.2~8.0蒸馏水1000mL 2结果和讨论 为了提供高盐环境，加入10000mgL的 NaCI以此培养基作为菌株的活化种瓶培养基. 2.1标准曲线 驯化培养基：蛋白胨5000mgL,NHPO4 对溴氨酸标准品进行可见吸收光谱的扫描 1300mg L,KH2 PO4 2 000 mg.L.MgSO (图1)，得到其最大吸收波长为485m以485m 1000mgL,CaCb溶液1mLL,FeCk溶液1mL: 为测定波长，测定多批不同质量浓度的溴氨酸单品 L,H7.28.0 标准溶液，以及不同溴氨酸质量浓度的唯一碳源无 1.2试验方法 机盐培养基标准溶液，绘制吸光度(OD值)一溴氨 (1)菌种筛选. 酸质量浓度曲线（图2）可以得出，培养基中其他 采样：本试验采用某化工污水处理站生物接触 成分对溶液中溴氨酸的吸光度值的测定没有影响， 氧化池的生物膜作为试验样品· 培养基中溴氨酸的质量浓度可以通过吸光度OD45 筛选培养：将所采集的生物膜在无菌水中震荡 值来表征 后，取上清液进行富集培养，经选择性培养基平板涂 0.18 布后得到平板混合菌株，对混合菌株进行液体选择 性培养基（溴氨酸的质量浓度为20mgL)的脱色 0.14 试验，通过传代试验验证菌株降解溴氨酸的能力， 0.10 再次涂布选择性培养基平板，分离纯化得到对溴氨 0.06 酸有降解脱色能力的若干株单菌落，采用逐级连续 传代驯化法对初筛得到的单菌株进行溴氨酸降解脱 0.02 色的驯化复筛，驯化初始，溴氨酸的质量浓度为 300 350400450500550 波长/nm 20mgL,以10mgL向上递增，每批次菌液传代 转接量为10%，直至溴氨酸的质量浓度为 图1溴氨酸吸收光谱 100mgL.最后复筛得到一株最优菌株. Fig 1 Absorption spectrmetry of bmmamn ine acid
第 11期 林 海等： 降解高含盐溴氨酸菌种的选育与鉴定 梯度驯化从某化工污水处理站生物接触氧化池的 生物膜中得到一株在高盐条件下对溴氨酸有较高降 解脱色能力的菌株并对影响该菌株降解溴氨酸的 因素进行了分析．最后对筛选得到的菌株进行了鉴 定以及 16ＳｒＤＮＡ的序列分析． 1 材料与方法 1∙1 试剂及培养基 （1） 试剂．溴氨酸购自金坛市威德龙化学有限 公司外观为橘红色粉状物溶于水其质量分数为 95％以上．其余试剂为市售分析纯． （2） 培养基． 富集培养基：牛肉膏 5000ｍｇ·Ｌ －1蛋白胨 10000ｍｇ·Ｌ －1ＮａＣｌ10000ｍｇ·Ｌ －1ｐＨ7∙2～8∙0 蒸馏水 1000ｍＬ． 选择性培养基：溴氨酸 200ｍｇ·Ｌ －1（ＮＨ4）2ＳＯ4 2000ｍｇ·Ｌ －1Ｋ2ＨＰＯ4 1400ｍｇ·Ｌ －1ＫＨ2ＰＯ4 600ｍｇ·Ｌ －1ＭｇＳＯ4100ｍｇ·Ｌ －1ＣａＣｌ2100ｍｇ·Ｌ －1 ＮａＣｌ10000ｍｇ·Ｌ －1琼脂 18000ｍｇ·Ｌ －1ｐＨ7∙2～ 8∙0． 种子培养基：牛肉膏 5000ｍｇ·Ｌ －1蛋白陈 10000ｍｇ·Ｌ －1ｐＨ7∙2～8∙0蒸馏水 1000ｍＬ． 为了提供高盐环境加入 10000ｍｇ·Ｌ －1的 ＮａＣｌ以此培养基作为菌株的活化种瓶培养基． 驯化培养基：蛋白胨 5000ｍｇ·Ｌ －1Ｎａ2ＨＰＯ4 1300ｍｇ·Ｌ －1ＫＨ2 ＰＯ4 2000 ｍｇ·Ｌ －1ＭｇＳＯ4 1000ｍｇ·Ｌ －1ＣａＣｌ2溶液 1ｍＬ·Ｌ －1ＦｅＣｌ3溶液 1ｍＬ· Ｌ －1ｐＨ7∙2～8∙0． 1∙2 试验方法 （1） 菌种筛选． 采样：本试验采用某化工污水处理站生物接触 氧化池的生物膜作为试验样品． 筛选培养：将所采集的生物膜在无菌水中震荡 后取上清液进行富集培养经选择性培养基平板涂 布后得到平板混合菌株对混合菌株进行液体选择 性培养基 （溴氨酸的质量浓度为 20ｍｇ·Ｌ －1 ）的脱色 试验通过传代试验验证菌株降解溴氨酸的能力． 再次涂布选择性培养基平板分离纯化得到对溴氨 酸有降解脱色能力的若干株单菌落．采用逐级连续 传代驯化法对初筛得到的单菌株进行溴氨酸降解脱 色的驯化复筛．驯化初始溴氨酸的质量浓度为 20ｍｇ·Ｌ －1以 10ｍｇ·Ｌ －1向上递增每批次菌液传代 转接 量 为 10％直 至 溴 氨 酸 的 质 量 浓 度 为 100ｍｇ·Ｌ －1．最后复筛得到一株最优菌株． （2） 菌株耐盐性研究．在溴氨酸的质量浓度为 100ｍｇ·Ｌ －1的无机盐驯化培养基中对最优菌株进 行耐盐性研究同样为逐级连续传代驯化法盐的质 量浓度为 10ｇ·Ｌ －1、30ｇ·Ｌ －1、70ｇ·Ｌ －1和 100ｇ·Ｌ －1． （3） 脱色菌氮源及其他特性研究．通过单因素 试验对菌株的最佳脱色培养基的氮源种类和用量 以及各影响因素进行研究．在溴氨酸的质量浓度为 100ｍｇ·Ｌ －1、ＮａＣｌ为 10ｇ·Ｌ －1的培养基中规定条 件：氮源培养基初始 ｐＨ7摇床转速 130ｒ·ｍｉｎ －1 250ｍＬ摇瓶中装液量 100ｍＬ接种量 10％．试验时 间为 40ｈ．试验过程中改变一个参数固定其他条 件进而确定菌株的最佳生长与降解条件． （4） 菌种鉴定．通过 Ｂｉｏｌｏｇ和分子生物学方法 对菌株进行鉴定． 1∙3 分析方法 生物量：在溴氨酸降解脱色试验过程中定时取 样测定 ＯＤ600值表征生物量． 脱色率：取不同时间的培养物 4ｍＬ在 6000 ｒ·ｍｉｎ －1的转速下离心 30ｍｉｎ以去离子水为空白 于溴氨酸的最大吸收波长 （485ｎｍ）处测其吸光度 其值反映培养基中溴氨酸的质量浓度． 2 结果和讨论 2∙1 标准曲线 对溴氨酸标准品进行可见吸收光谱的扫描 （图 1）得到其最大吸收波长为 485ｎｍ．以 485ｎｍ 为测定波长测定多批不同质量浓度的溴氨酸单品 标准溶液以及不同溴氨酸质量浓度的唯一碳源无 机盐培养基标准溶液绘制吸光度 （ＯＤ值 ） －溴氨 酸质量浓度曲线 （图 2）．可以得出培养基中其他 成分对溶液中溴氨酸的吸光度值的测定没有影响． 培养基中溴氨酸的质量浓度可以通过吸光度 ＯＤ485 值来表征． 图 1 溴氨酸吸收光谱 Ｆｉｇ．1 Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙｏｆｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄ ·1401·
,1402 北京科技大学学报 第32卷 1.8 18 =0.0155x+0.0284 (aj =0.0154x+0.0363 14 R=0.9994 1.4 R=0.9994 0.6 0.6 02 0.2 20 40 0 80 100 20 40 6080 100 溴氨酸浓度mgL 溴氨酸浓度mgL中 图2标准曲线.()溴氨酸单品溶液；(b)唯一碳源无机盐培养基 Fig 2 Standand curve (a)sngle itemn solution of brman ne ac (b)inorganic salt medim with sole cathon soure 2.2菌种初筛 为1%~3%时对菌株的生长和脱色没有影响，菌株 经过长时间的富集筛选，分离纯化得到10株对 耐受力很强，脱色率可达到8O%以上，在NaC1为 溴氨酸具有降解脱色能力的单菌落 %时，菌株也具有较高的耐受力，脱色率可达到 2.3菌种驯化复筛 50%以上，同时从图3中可以看出，NaC的存在也 通过溴氨酸质量浓度的逐级驯化，考察10株单 抑制溴氨酸的降解.NaC1质量分数为10%时对菌 菌对溴氨酸的耐受和降解脱色能力，10株单菌平行 株的生长产生完全抑制作用，菌株不能生长和降解 培养条件，由溴氨酸质量浓度20mgL开始，连续 溴氨酸，已报道的菌株Sphingomonas sp FL在 逐级驯化到溴氨酸质量浓度为100mgL.通过传 NaC质量分数小于%时对脱色有促进作用，大于 代稳定性试验，复筛得到一株最优菌株，命名为 3%时溴氨酸不发生降解).另一报道中，菌株Z0 C-7. gloea HP3在NaCl质量分数小于1%时对菌体的生 2.4耐盐性试验 长影响不大，%时已经显著影响了溴氨酸的降 对复筛得到的菌株C一7进行耐盐性试验.在 解).本试验中的菌株C一7与前面的两种菌株比 每一不同NaC质量分数的培养基中，于不同时间测 较，显示出了比较强的耐盐性，在高盐条件下对溴氨 定菌体生长量和溴氨酸的脱色情况，菌体浓度可以 酸的降解脱色能力仍较强 通过吸光度ODo值来表征，结果如图3所示.NaCl 80 30 90 3.0 2.5 60 20 560 2.0 40 115 15 一第一代脱色率 0-第二代脱色率 0 30 1.0 之 女第一代菌体浓度 0.5 0.5 ☆第二代消体浓度 0 24 43 48 67 72 96 时间h 时间h 70 3.0 0.6 2.5 2.5 0.5 2.0 2.0 空04 5 0.3 1.0 20 1.0 0.2 .5 0.5 10 0.1 24 7296 15 24 29 53 时间h 时间h 图3不同NaC质量分数对菌株C一7的生长和溴氨酸降解的影响.(a)%NaC!(b)%NaC上(c)7%NC!(d)1%NC1 Fig 3 Efeets of NaClmass fraction on the gnow th of strain C7 and the degmadation of brmamn ine acid (a)1%NaC (b)3 Nac (c)7% NaC:(d)10%Nacl
北 京 科 技 大 学 学 报 第 32卷 图 2 标准曲线．（ａ） 溴氨酸单品溶液；（ｂ） 唯一碳源无机盐培养基 Ｆｉｇ．2 Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ：（ａ） ｓｉｎｇｌｅｉｔｅｍｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄ；（ｂ） ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈｓｏｌｅｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ 2∙2 菌种初筛 经过长时间的富集筛选分离纯化得到 10株对 溴氨酸具有降解脱色能力的单菌落． 2∙3 菌种驯化复筛 通过溴氨酸质量浓度的逐级驯化考察 10株单 菌对溴氨酸的耐受和降解脱色能力10株单菌平行 培养条件由溴氨酸质量浓度 20ｍｇ·Ｌ －1开始连续 逐级驯化到溴氨酸质量浓度为 100ｍｇ·Ｌ －1．通过传 代稳定性试验复筛得到一株最优菌株命名为 Ｃ－7． 2∙4 耐盐性试验 对复筛得到的菌株 Ｃ－7进行耐盐性试验．在 每一不同 ＮａＣｌ质量分数的培养基中于不同时间测 定菌体生长量和溴氨酸的脱色情况菌体浓度可以 通过吸光度 ＯＤ600值来表征结果如图 3所示．ＮａＣｌ 为 1％ ～3％时对菌株的生长和脱色没有影响菌株 耐受力很强脱色率可达到 80％以上．在 ＮａＣｌ为 7％时菌株也具有较高的耐受力脱色率可达到 50％以上．同时从图 3中可以看出ＮａＣｌ的存在也 抑制溴氨酸的降解．ＮａＣｌ质量分数为 10％时对菌 株的生长产生完全抑制作用菌株不能生长和降解 溴氨酸．已报道的菌株 Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．ＦＬ在 ＮａＣｌ质量分数小于 2％时对脱色有促进作用大于 3％时溴氨酸不发生降解 ［8］．另一报道中菌株 Ｚｏｏ- ｇｌｏｅａＨＰ3在 ＮａＣｌ质量分数小于 1％时对菌体的生 长影响不大2％时已经显著影响了溴氨酸的降 解 ［9］．本试验中的菌株 Ｃ－7与前面的两种菌株比 较显示出了比较强的耐盐性在高盐条件下对溴氨 酸的降解脱色能力仍较强． 图 3 不同 ＮａＣｌ质量分数对菌株 Ｃ－7的生长和溴氨酸降解的影响．（ａ）1％ ＮａＣｌ；（ｂ）3％ ＮａＣｌ；（ｃ）7％ ＮａＣｌ；（ｄ）10％ ＮａＣｌ Ｆｉｇ．3 ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＮａＣｌｍａｓｓｆｒａｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｓｔｒａｉｎＣ-7ａｎｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｂｒｏｍａｍｉｎｅａｃｉｄ：（ａ） 1％ ＮａＣｌ；（ｂ） 3％ ＮａＣｌ；（ｃ） 7％ ＮａＣｌ；（ｄ）10％ ＮａＣｌ ·1402·
第11期 林海等：降解高含盐溴氨酸菌种的选育与鉴定 .1403. 2.5氮源对菌株降解溴氨酸的影响 2.6培养基初始pH值对菌株降解溴氨酸的影响 (1)氮源种类，氨是微生物必不可少的营养元 通过调节培养基初始H值（图6），表明该菌 素之一，微生物对底物分子中的氨、磷等营养元素的 株生物降解反应的最佳H值为7.0在偏酸或偏 利用具有一定的选择性，分别在溴氨酸质量浓度为 碱的状态下脱色率均不高，这说明培养基初始H 100mgL的无机盐培养基中加入等量的酵母粉、 值变化对菌株C一7的脱色影响非常明显，在驯化 蛋白胨、尿素、NH4C1和(NH4)2SO4·从图4可以看 培养过程中，保持一个适当又稳定的H值范围是 出，菌株可以利用多种氨源对溴氨酸进行降解脱色， 很重要的，其中，酸性比碱性对菌株脱色影响更大， 其中酵母粉和蛋白胨最易被菌体利用而降解溴氨 58 4.0 酸，而NHC1(NH)2SO作为氮源时，脱色率不高， 一脱色率 3.8 54 一·菌体浓度 己报道的菌株Sphingamonas sp FL不能利用溴氨 36 酸分子中的氮，易利用NH4C1(NH:)2SO4作为氮 号50 源可).另一报道中菌株Zoog loea HP3可以利用溴氨 .2 酸为唯一碳、氨源生长，NH4C的添加对溴氨酸的降 解有抑制作用[⑧).本试验中菌株C一7最佳氨源为 3.0 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 培养基初始H值 蛋白胨，难以利用溴氨酸分子中的氮， 50 3.0 图6H值对C一7菌株脱色的影响（反应40h后） 一脱色率 2.5 Fig 6 Effect of pH vales on decolorization with the strain C7 af +南体液度 30 20 ter reaction for 40h) 20 2.7接种量对菌株降解溴氨酸的影响 如图7所示，随接种量由3%增至20%，培养液 0.5 0 的菌浓和脱色率均逐渐增加，但接种量为10%时， 酵母粉 蛋白胨 尿素 氧化铵 硫酸筱 脱色率达到50%左右，继续加大接种量，脱色率的 氨源种类 增加不明显，因此10%的转接量比较合理，既能保 图4氮源种类对C一7菌株脱色的影响（反应40h后） 证C一7菌株的生长，又能保证较好的脱色率. Fig 4 Effect of nitrogen sources on decobrization with the stran C-7 60r (after reaction for40h) 口脱色￥ 50一菌体浓度 (2)氮源用量，考察蛋白胨用量对菌株生长和 脱色的影响，将菌体C一7置于不同蛋白胨质量浓 度的培养基中，反应40h后测定菌体生长量和溴氨 20 酸的含量，结果见图5蛋白胨质量浓度为7gL 和10gL时，菌种培养液的脱色率相差不大，均可 达到50%左右的脱色率.蛋白胨用量增多并未促进 10 15 20 接种量保 菌体的脱色，因此选择蛋白胨最佳质量浓度为 7gL 图7接种量对菌株脱色的影响（反应40h后） 3.5 Fig 7 Effect of inocuhm concentration on decobrization with the 一脱色率◆南体浓度 strain C7 (after reaction for40 h) 芝40 2.5 15 2.8溶氧状况对菌株降解溴氨酸的影响 溶氧状况可由摇床转速和装液量来表征，由结 10 果可知（图8），摇床转速为160rmn和200mn 蛋白胨浓度gL) 时，培养基脱色率近乎相等，160rmm的转速已可 图5蛋白陈质量浓度对菌株脱色的影响（反应40后） 为反应提供足够的溶氧，当装液量为80mL100 Fig 5 Effect of the mass concentration of peptone on decolorization mL120mL时，培养液的脱色率均较高，其中以装液 with the strain C-7(after reaction for 40 h) 量为120mL时最为显著
第 11期 林 海等： 降解高含盐溴氨酸菌种的选育与鉴定 2∙5 氮源对菌株降解溴氨酸的影响 （1） 氮源种类．氮是微生物必不可少的营养元 素之一微生物对底物分子中的氮、磷等营养元素的 利用具有一定的选择性．分别在溴氨酸质量浓度为 100ｍｇ·Ｌ －1的无机盐培养基中加入等量的酵母粉、 蛋白胨、尿素、ＮＨ4Ｃｌ和 （ＮＨ4）2ＳＯ4．从图 4可以看 出菌株可以利用多种氮源对溴氨酸进行降解脱色 其中酵母粉和蛋白胨最易被菌体利用而降解溴氨 酸而 ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4作为氮源时脱色率不高． 已报道的菌株 Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．ＦＬ不能利用溴氨 酸分子中的氮易利用 ＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4 ）2ＳＯ4作为氮 源 ［7］．另一报道中菌株 ＺｏｏｇｌｏｅａＨＰ3可以利用溴氨 酸为唯一碳、氮源生长ＮＨ4Ｃｌ的添加对溴氨酸的降 解有抑制作用 ［8］．本试验中菌株 Ｃ－7最佳氮源为 蛋白胨难以利用溴氨酸分子中的氮． 图 4 氮源种类对 Ｃ－7菌株脱色的影响 （反应 40ｈ后 ） Ｆｉｇ．4 ＥｆｆｅｃｔｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｏｎｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒａｉｎＣ-7 （ａｆｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒ40ｈ） （2） 氮源用量．考察蛋白胨用量对菌株生长和 脱色的影响将菌体 Ｃ－7置于不同蛋白胨质量浓 度的培养基中反应 40ｈ后测定菌体生长量和溴氨 酸的含量结果见图 5．蛋白胨质量浓度为 7ｇ·Ｌ －1 和 10ｇ·Ｌ －1时菌种培养液的脱色率相差不大均可 达到50％左右的脱色率．蛋白胨用量增多并未促进 菌体的脱色因此选择蛋白胨最佳质量浓度为 7ｇ·Ｌ －1． 图 5 蛋白胨质量浓度对菌株脱色的影响 （反应 40ｈ后 ） Ｆｉｇ．5 Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｅｐｔｏｎｅｏｎｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒａｉｎＣ－7（ａｆｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒ40ｈ） 2∙6 培养基初始 ｐＨ值对菌株降解溴氨酸的影响 通过调节培养基初始 ｐＨ值 （图 6）表明该菌 株生物降解反应的最佳 ｐＨ值为 7∙0．在偏酸或偏 碱的状态下脱色率均不高这说明培养基初始 ｐＨ 值变化对菌株 Ｃ－7的脱色影响非常明显．在驯化 培养过程中保持一个适当又稳定的 ｐＨ值范围是 很重要的．其中酸性比碱性对菌株脱色影响更大． 图 6 ｐＨ值对 Ｃ－7菌株脱色的影响 （反应 40ｈ后 ） Ｆｉｇ．6 ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨｖａｌｕｅｓｏｎｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒａｉｎＣ-7（ａｆ- ｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒ40ｈ） 2∙7 接种量对菌株降解溴氨酸的影响 如图 7所示随接种量由 3％增至 20％培养液 的菌浓和脱色率均逐渐增加但接种量为 10％时 脱色率达到 50％左右继续加大接种量脱色率的 增加不明显因此 10％的转接量比较合理既能保 证 Ｃ－7菌株的生长又能保证较好的脱色率． 图 7 接种量对菌株脱色的影响 （反应 40ｈ后 ） Ｆｉｇ．7 Ｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅ ｓｔｒａｉｎＣ-7（ａｆｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒ40ｈ） 2∙8 溶氧状况对菌株降解溴氨酸的影响 溶氧状况可由摇床转速和装液量来表征．由结 果可知 （图8）摇床转速为 160ｒ·ｍｉｎ －1和 200ｒ·ｍｉｎ －1 时培养基脱色率近乎相等160ｒ·ｍｉｎ －1的转速已可 为反应提供足够的溶氧．当装液量为 80ｍＬ、100 ｍＬ、120ｍＬ时培养液的脱色率均较高其中以装液 量为 120ｍＬ时最为显著． ·1403·
,1404 北京科技大学学报 第32卷 60 4.0 4 口脱色率 a 脱色率 50 +黄体浓度 3.8 菌体 浓度 3 0 0 3.6 30 3.4 20- 10- 3.2 3.0 130 160 200 50 80 100 120 150 摇床转速rmin) 装液量mL 图8溶氧状况对C一7菌株脱色的影响（反应40h后），(a)摇床转速；(b)装液量 Fig 8 Effect of dissolved oxygen on decolorization with he strain C7 (after reaction for40h):(a)shaker motation rate (b)vohme of liquid 2.9最佳培养条件下生长曲线的绘制 2.10菌种鉴定 综合上述优化后的最佳培养条件，配制高盐度 2.10.1脱色菌的生理生化鉴定 (NaC1质量分数为1%)、溴氨酸（质量浓度为 本试验采用Biolog全自动微生物鉴定仪，对菌 100mgL)为唯一碳源的无机盐培养基，绘制菌株 株C一7进行鉴定，Biolog鉴定主要是利用微生物 C一7的生长和脱色情况随时间变化的曲线，如图9 对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选 所示.可见，在此条件下，菌体生长良好，其OD最 95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC 大值为2.805.50h后菌种生长趋于平缓，溴氨酸的 TV),固定于96孔板上(A1孔为阴性对照)，接种菌 脱色率达到50%以上，而后逐渐变缓，最终脱色率 悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不 可达85%以上. 同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化一还原酶与 % 显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度），以 25 及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标准 60 20 菌株数据库进行比对，得到最终鉴定结果 15 菌株氧化酶反应阴性，三糖铁试验为AA,初 20 口-脱色率 1.0 步试验确定为革兰氏阴性肠道菌，37℃培养，鉴定 。-菌体浓度 忽 0.5 结果见图10 4~6h的试验结果显示菌株为柠檬酸菌属 0 12 24 3450 65 91 时间A (Citrobacter sp),l6~24h的鉴定结果为费氏柠檬 酸杆菌，综合考虑菌株C一7的鉴定结果，确定为费 图9菌株的生长和脱色情况随时间变化的曲线 Fig9 Changes n grow th and decolorization of the stramn w ith tie 氏柠檬酸杆菌 DW (b) 图10菌株Biog生理生化特性鉴定结果.(a)6:(b)24h Fig 10 lentification results of the physio biochen ical chamcteristics of the stran by Biolog (a)6 (b)24 h
北 京 科 技 大 学 学 报 第 32卷 图 8 溶氧状况对 Ｃ－7菌株脱色的影响 （反应 40ｈ后 ）．（ａ） 摇床转速；（ｂ） 装液量 Ｆｉｇ．8 ＥｆｆｅｃｔｏｆｄｉｓｓｏｌｖｅｄｏｘｙｇｅｎｏｎｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒａｉｎＣ-7（ａｆｔｅｒｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒ40ｈ）：（ａ） ｓｈａｋｅｒｒｏｔａｔｉｏｎｒａｔｅ；（ｂ） ｖｏｌｕｍｅｏｆｌｉｑｕｉｄ 2∙9 最佳培养条件下生长曲线的绘制 综合上述优化后的最佳培养条件配制高盐度 （ＮａＣｌ质 量 分 数 为 1％ ）、溴 氨 酸 （质 量 浓 度 为 100ｍｇ·Ｌ －1 ）为唯一碳源的无机盐培养基绘制菌株 Ｃ－7的生长和脱色情况随时间变化的曲线如图 9 所示．可见在此条件下菌体生长良好其 ＯＤ600最 大值为 2∙805．50ｈ后菌种生长趋于平缓溴氨酸的 脱色率达到 50％以上而后逐渐变缓最终脱色率 可达 85％以上． 图 9 菌株的生长和脱色情况随时间变化的曲线 Ｆｉｇ．9 Ｃｈａｎｇｅｓｉｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｗｉｔｈｔｉｍｅ 2∙10 菌种鉴定 2∙10∙1 脱色菌的生理生化鉴定 本试验采用 Ｂｉｏｌｏｇ全自动微生物鉴定仪对菌 株 Ｃ－7进行鉴定．Ｂｉｏｌｏｇ鉴定主要是利用微生物 对不同碳源代谢率的差异针对每一类微生物筛选 95种不同碳源配合四唑类显色物质 （如 ＴＴＣ、 ＴＶ）固定于 96孔板上 （Ａ1孔为阴性对照 ）接种菌 悬液后培养一定时间通过检测微生物细胞利用不 同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化 －还原酶与 显色物质发生反应而导致的颜色变化 （吸光度 ）以 及由于微生物生长造成的浊度差异 （浊度 ）与标准 菌株数据库进行比对得到最终鉴定结果． 菌株氧化酶反应阴性三糖铁试验为 Ａ／Ａ初 步试验确定为革兰氏阴性肠道菌37℃培养鉴定 结果见图 10． 4～6ｈ的试验结果显示菌株为柠檬酸菌属 （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）16～24ｈ的鉴定结果为费氏柠檬 酸杆菌综合考虑菌株 Ｃ－7的鉴定结果确定为费 氏柠檬酸杆菌． 图 10 菌株 Ｂｉｏｌｏｇ生理生化特性鉴定结果．（ａ）6ｈ；（ｂ）24ｈ Ｆｉｇ．10 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｐｈｙｓｉｏ-ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｂｙＢｉｏｌｏｇ：（ａ）6ｈ；（ｂ）24ｈ ·1404·