胶质芽孢杆菌HJ07的UV与NTG诱变育种及其对铝土矿浸矿效果

D0L:10.13374.issn1001-053x.2013.10.005 第35卷第10期 北京科技大学学报 Vol.35 No.10 2013年10月 Journal of University of Science and Technology Beijing 0ct.2013 胶质芽孢杆菌HJO7的UV与NTG诱变育种及 其对铝土矿浸矿效果 孙德四1,2)☒，王化军2)，张强2) 1)九江学院化学与环境工程学院，九江3320052)北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083 冈通信作者，E-mail:sundesi1215@126.com 摘要以从河南铝土矿样筛选出的一株胶质芽孢杆菌HJ07为出发菌株，对其进行紫外(UV)与亚硝基胍(NTG)诱 变育种及铝土矿浸矿脱硅研究.分别通过紫外线照射120s与采用质量浓度为600gL~1的亚硝基胍处理，出发菌株 HJ07的致死率分别达到89%与90%，正突变率分别达到16.5%与18.7%.从突变菌株中筛选所得的两株菌种UV-2与 NTG-5的生长代谢活性与脱硅能力明显比出发菌株高.在铝土矿浸出体系中，UV-2与NTG5达到生长稳定期的时间 比HJ07分别缩短了48h与24h,且生长稳定期具有更大的细菌浓度.浸矿12d后，UV-2与NTG-5菌株浸出液中 SiO2的质量浓度分别比H07提高了约25.6%与12.5%，且达到浸出终点的时间分别缩短了3d和2d.UV-2与NTG-5 菌株较出发菌株HJ07具有更强的产酸与产胞外聚合物的能力.被UV-2菌株作用后的铝土矿表面的溶蚀程度更加显 著，矿物表面形成了明显的菌胶团. 关键词铝土矿处理：生物浸矿：胶质芽孢杆菌：诱变 分类号TD925 Breeding of Bacillus mucilaginosus HJO7 mutated by UV/NTG and its effects on microbial leaching of bauxite SUN De-si12),WANG Hua-jun2),ZHANG Qiang?) 1)School of Chemistry and Environmental Engineering,Jiujiang University,Jiujiang 332005,China 2)School of Civil and Environmental Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China Corresponding author,E-mail:sundesi1215@126.com ABSTRACT An original strain Bacillus mucilaginosus HJ07 was screened from bauxite sampled from Henan Province of China.It was induced mutagenesis by ultraviolet (UV)radiating and nitrosoguanidine (NTG)culturing,and then was used for bioleaching silicon from bauxite.After treated by 120s UV radiating and 600 mg-L-NTG culturing, its kill rates are 89%and 90%,and its positive mutation rates are 16.5%and 18.7%,respectively.Two mutant strains UV-2 and NTG-5 were screened from a large number of mutant strains,and they have better bioactivity and de-silicon efficiency than HJ07 strain.In comparison with HJ07 strain,the time that UV-2 and NTG-5 strains reach stable growth in bauxite bioleaching systems shortens by 48 h and 24 h,respectively,and they have higher bacterial concentrations. After 12 d bioleaching,SiO2 mass concentrations in leachates of UV-2 and NTG-5 stains improve by about 25.6%and 12.5%,and the time that UV-2 and NTG-5 strains reach the leaching terminal point shortens by 3d and 2 d,respectively. UV-2 and NTG-5 strains can produce much more organic acids and extracellular polymeric substances than HJ07 strain. Moreover,mineral particle surfaces leached by UV-2 strain are eroded much more obviously and covered with a thicker layer of zooglea. 收稿日期：2012-08-24 基金项目：因家自然科学基金资助项目(51064011：5126401431360064)

第 35 卷 第 10 期 北 京 科 技 大 学 学 报 Vol. 35 No. 10 2013 年 10 月 Journal of University of Science and Technology Beijing Oct. 2013 胶质芽孢杆菌 HJ07 的 UV 与 NTG 诱变育种及 其对铝土矿浸矿效果 孙德四1,2) ，王化军2)，张 强2) 1) 九江学院化学与环境工程学院，九江 332005 2) 北京科技大学土木与环境工程学院，北京 100083 通信作者，E-mail: sundesi1215@126.com 摘 要 以从河南铝土矿样筛选出的一株胶质芽孢杆菌 HJ07 为出发菌株，对其进行紫外 (UV) 与亚硝基胍 (NTG) 诱 变育种及铝土矿浸矿脱硅研究. 分别通过紫外线照射 120 s 与采用质量浓度为 600 mg·L −1 的亚硝基胍处理，出发菌株 HJ07 的致死率分别达到 89%与 90%，正突变率分别达到 16.5%与 18.7%. 从突变菌株中筛选所得的两株菌种 UV-2 与 NTG-5 的生长代谢活性与脱硅能力明显比出发菌株高. 在铝土矿浸出体系中，UV-2 与 NTG-5 达到生长稳定期的时间 比 HJ07 分别缩短了 48 h 与 24 h，且生长稳定期具有更大的细菌浓度. 浸矿 12 d 后，UV-2 与 NTG-5 菌株浸出液中 SiO2 的质量浓度分别比 HJ07 提高了约 25.6%与 12.5%，且达到浸出终点的时间分别缩短了 3 d 和 2 d. UV-2 与 NTG-5 菌株较出发菌株 HJ07 具有更强的产酸与产胞外聚合物的能力. 被 UV-2 菌株作用后的铝土矿表面的溶蚀程度更加显 著，矿物表面形成了明显的菌胶团. 关键词 铝土矿处理；生物浸矿；胶质芽孢杆菌；诱变 分类号 TD925 Breeding of Bacillus mucilaginosus HJ07 mutated by UV/NTG and its effects on microbial leaching of bauxite SUN De-si 1,2) , WANG Hua-jun2), ZHANG Qiang2) 1) School of Chemistry and Environmental Engineering, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China 2) School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China Corresponding author, E-mail: sundesi1215@126.com ABSTRACT An original strain Bacillus mucilaginosus HJ07 was screened from bauxite sampled from Henan Province of China. It was induced mutagenesis by ultraviolet (UV) radiating and nitrosoguanidine (NTG）culturing, and then was used for bioleaching silicon from bauxite. After treated by 120 s UV radiating and 600 mg·L −1 NTG culturing, its kill rates are 89% and 90%, and its positive mutation rates are 16.5% and 18.7%, respectively. Two mutant strains UV-2 and NTG-5 were screened from a large number of mutant strains, and they have better bioactivity and de-silicon efficiency than HJ07 strain. In comparison with HJ07 strain, the time that UV-2 and NTG-5 strains reach stable growth in bauxite bioleaching systems shortens by 48 h and 24 h, respectively, and they have higher bacterial concentrations. After 12 d bioleaching, SiO2 mass concentrations in leachates of UV-2 and NTG-5 stains improve by about 25.6% and 12.5%, and the time that UV-2 and NTG-5 strains reach the leaching terminal point shortens by 3 d and 2 d, respectively. UV-2 and NTG-5 strains can produce much more organic acids and extracellular polymeric substances than HJ07 strain. Moreover, mineral particle surfaces leached by UV-2 strain are eroded much more obviously and covered with a thicker layer of zooglea. 收稿日期：2012-08-24 基金项目：国家自然科学基金资助项目 (51064011; 51264014; 31360064) DOI:10.13374/j.issn1001-053x.2013.10.005

第10期 孙德四等：胶质芽孢杆菌HJ07的UV与NTG诱变育种及其对铝土矿浸矿效果 ·1269· KEY WORDS bauxite ore treatment;bioleaching;Bacillus mucilaginosus:mutagenesis 随着优质铝土矿资源的日趋匮乏，高硅、高铁、双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导 低铝硅比的铝土矿资源的开发和利用日益受到人们致基因突变，从而引起DNA中的GC一→AT的转换 的重视1-.长期以来，铝土矿脱硅主要采用物理 或移码突变：亚硝基胍是一种能与核酸碱基作用的 及化学方法，但这些方法均存在明显缺陷.微生 双功能烷化剂，可与DNA分子的许多部位发生作 物方法脱硅因其具有高选择性、高脱硅率与无环境 用，结果使DNA分子增加了烷基侧链（烷化作用）， 污染等优点而广受关注4.在20世纪70一90年 从而改变了DNA分子结构，同时它还能在DNA双 代，俄罗斯、保加利亚与印度开展了关于铝土矿微 链间形成共价键，这样就阻碍了在DNA复制过程 生物选矿的研究，并取得了大量的理论研究成 中双链的解开，引起突变，其主要生物效应是引起 果6-，但进入21世纪，就未见相关报道，且至 酵母DNA链GC一→AT的转换[29-3别. 今尚无微生物方法脱硅工业化应用实例.铝土矿中 本文选用一株从河南铝土刊矿样中筛选出具有 的硅主要赋存于脉石矿物如高岭石、石英等硅酸盐 优良浸出铝土矿中硅的胶质芽孢杆菌BMHJ07作 矿物中，因此铝土矿微生物选矿的实质是利用特定 为出发菌株，采用紫外线(UV)与亚硝基胍(NTG) 微生物风化降解铝土矿中的硅酸盐矿物，从而释放 对出发菌株进行诱变育种，通过对诱变菌株的初筛 其中的硅、铁等有害元素o!.大量研究表明，微生 与复筛及遗传稳定性实验，筛选出两株具有较高铝 物主要通过有机酸酸解、胞外聚合物络解和氧化还 土矿脱硅效果的菌株UV-2和NTG-5,并以出发菌 原作用的方式风化硅酸盐矿物，因此微生物产酸、 株作为对照，对比分析了它们对铝土矿的降解脱硅 产胞外聚合物的能力直接影响其对硅酸盐矿物的降 性能. 解效果1-16.迄今为止，从土壤与铝硅酸盐矿场 中分离得到了细菌、真菌等多个能分解硅酸盐矿物 1 实验 的微生物种属[17-2四.用于铝土矿脱硅的菌种中 1.1实验矿样 效果最好的为环状芽孢杆菌与黏液胶质芽孢杆菌， 实验所用纯高岭石矿样购买于中国地质博物 浸刊矿过程中菌种对铝硅酸盐的脱硅作用是由细菌 馆，矿样纯度为98%：浸矿用铝土刊矿样品采自河 代谢产生的大分子胞外聚合物与硅结合成络合物， 南中州铝厂（焦作）选矿铝土矿原矿样，为沉积型 以及细菌代谢与分解大分子有机物产生的小分子有 一水硬铝石铝土矿，脉石矿物主要为硅酸盐矿物， 机酸酸解硅酸盐或铝硅酸盐的间接作用两部分组成 通过X射线衍射分析，其主要矿物组成为（质量 的14,23-2.目前，所有有关铝土矿微生物选矿技 分数，%)：水铝石64.6，高岭石16.50，伊利石 术仍处于理论与实验室研究阶段，制约其工业化应 9.1,石英1.63，铁矿物5.40，方解石2.50：主要 用的原因主要有：菌种生长速率缓慢，生物浸出周 化学组成为（质量分数，%）：A12O365.00,SiO2 期较长：优良浸矿性能菌种筛选难度大，不同环境 12.58,Fe2034.53,Ti021.09,K201.09,Ca0 筛选所得菌种产酸、产胞外聚合物的能力不同：菌 1.55,Mg00.13,Na201.17.将原矿样磨至≤75m, 种性能不稳定，多次传代培养后分解硅酸盐矿物的 备细菌浸脱硅矿用 能力会显著降低.这些缺陷急需在生物浸矿过程中 1.2出发菌株 得到解决 实验菌株HJ07为胶质芽孢杆菌(Bacillus mu- 在湿法治金与矿物加工领域，国内外有关浸 cilaginosus).该菌株筛选自河南铝土矿样，通过对 矿菌种的诱变育种技术的大量研究成果主要应用 菌种的生理生化特征与16 S rRNA的基因序列进行 于铜矿、硫铁矿等重金属与贵金属矿物的生物浸 鉴定，可以确定该菌种属于胶质芽孢杆菌，同源度 出26-2网，至今很少有关用于铝土矿脱硅的“硅酸 98%,其16 S rRNA基因序列在GenBank中登陆号 盐”细菌诱变育种方面的报道.紫外线(UV)与亚硝 为[EU781523].对菌株先后在含铝硅酸盐矿物（纯 基胍(NTG)是目前最常用且有效的物理与化学诱 高岭石、铝土矿原矿)的该类菌种专性培养基0,13 变剂.紫外线辐照能引起细菌DNA链的断裂、DNA 中分别进行驯化培养.HJ07菌株的最佳生长条件 分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联以及为：初始pH值为7.0，培养温度为2830℃，摇床 胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，并且主要使细菌内 转速为150200rmin-1.在装有90mL培养基的 形成胸腺嘧啶二聚体，胸腺嘧啶二聚体会阻碍DNA 250mL的锥型瓶中，加入≤75m(-200目)纯高

第 10 期 孙德四等：胶质芽孢杆菌 HJ07 的 UV 与 NTG 诱变育种及其对铝土矿浸矿效果 1269 ·· KEY WORDS bauxite ore treatment; bioleaching; Bacillus mucilaginosus; mutagenesis 随着优质铝土矿资源的日趋匮乏，高硅、高铁、 低铝硅比的铝土矿资源的开发和利用日益受到人们 的重视 [1−2] . 长期以来，铝土矿脱硅主要采用物理 及化学方法，但这些方法均存在明显缺陷 [3] . 微生 物方法脱硅因其具有高选择性、高脱硅率与无环境 污染等优点而广受关注 [4] . 在 20 世纪 70—90 年 代，俄罗斯、保加利亚与印度开展了关于铝土矿微 生物选矿的研究，并取得了大量的理论研究成 果 [5−9]，但进入 21 世纪，就未见相关报道，且至 今尚无微生物方法脱硅工业化应用实例. 铝土矿中 的硅主要赋存于脉石矿物如高岭石、石英等硅酸盐 矿物中，因此铝土矿微生物选矿的实质是利用特定 微生物风化降解铝土矿中的硅酸盐矿物，从而释放 其中的硅、铁等有害元素 [10] . 大量研究表明，微生 物主要通过有机酸酸解、胞外聚合物络解和氧化还 原作用的方式风化硅酸盐矿物，因此微生物产酸、 产胞外聚合物的能力直接影响其对硅酸盐矿物的降 解效果 [11−16] . 迄今为止，从土壤与铝硅酸盐矿场 中分离得到了细菌、真菌等多个能分解硅酸盐矿物 的微生物种属 [17−22] . 用于铝土矿脱硅的菌种中 效果最好的为环状芽孢杆菌与黏液胶质芽孢杆菌， 浸矿过程中菌种对铝硅酸盐的脱硅作用是由细菌 代谢产生的大分子胞外聚合物与硅结合成络合物， 以及细菌代谢与分解大分子有机物产生的小分子有 机酸酸解硅酸盐或铝硅酸盐的间接作用两部分组成 的 [14,23−25] . 目前，所有有关铝土矿微生物选矿技 术仍处于理论与实验室研究阶段，制约其工业化应 用的原因主要有：菌种生长速率缓慢，生物浸出周 期较长；优良浸矿性能菌种筛选难度大，不同环境 筛选所得菌种产酸、产胞外聚合物的能力不同；菌 种性能不稳定，多次传代培养后分解硅酸盐矿物的 能力会显著降低. 这些缺陷急需在生物浸矿过程中 得到解决. 在湿法冶金与矿物加工领域，国内外有关浸 矿菌种的诱变育种技术的大量研究成果主要应用 于铜矿、硫铁矿等重金属与贵金属矿物的生物浸 出 [26−28]，至今很少有关用于铝土矿脱硅的 “硅酸 盐” 细菌诱变育种方面的报道. 紫外线 (UV) 与亚硝 基胍 (NTG) 是目前最常用且有效的物理与化学诱 变剂. 紫外线辐照能引起细菌 DNA 链的断裂、DNA 分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联以及 胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等，并且主要使细菌内 形成胸腺嘧啶二聚体，胸腺嘧啶二聚体会阻碍 DNA 双链的解链和复制，阻碍碱基的正常配对，从而导 致基因突变，从而引起 DNA 中的 GC→AT 的转换 或移码突变；亚硝基胍是一种能与核酸碱基作用的 双功能烷化剂，可与 DNA 分子的许多部位发生作 用，结果使 DNA 分子增加了烷基侧链 (烷化作用)， 从而改变了 DNA 分子结构，同时它还能在 DNA 双 链间形成共价键，这样就阻碍了在 DNA 复制过程 中双链的解开，引起突变，其主要生物效应是引起 酵母 DNA 链 GC→AT 的转换 [29−31] . 本文选用一株从河南铝土矿样中筛选出具有 优良浸出铝土矿中硅的胶质芽孢杆菌 B·M HJ07 作 为出发菌株，采用紫外线 (UV) 与亚硝基胍 (NTG) 对出发菌株进行诱变育种，通过对诱变菌株的初筛 与复筛及遗传稳定性实验，筛选出两株具有较高铝 土矿脱硅效果的菌株 UV-2 和 NTG-5，并以出发菌 株作为对照，对比分析了它们对铝土矿的降解脱硅 性能. 1 实验 1.1 实验矿样 实验所用纯高岭石矿样购买于中国地质博物 馆，矿样纯度为 98%；浸矿用铝土矿样品采自河 南中州铝厂 (焦作) 选矿铝土矿原矿样，为沉积型 一水硬铝石铝土矿，脉石矿物主要为硅酸盐矿物， 通过 X 射线衍射分析，其主要矿物组成为 (质量 分数，%)： 水铝石 64.6， 高岭石 16.50， 伊利石 9.1，石英 1.63，铁矿物 5.40，方解石 2.50；主要 化学组成为 (质量分数，%)：Al2O3 65.00，SiO2 12.58，Fe2O3 4.53，TiO2 1.09，K2O 1.09，CaO 1.55，MgO 0.13，Na2O 1.17. 将原矿样磨至 675 µm， 备细菌浸脱硅矿用. 1.2 出发菌株 实验菌株 HJ07 为胶质芽孢杆菌 (Bacillus mu￾cilaginosus). 该菌株筛选自河南铝土矿样，通过对 菌种的生理生化特征与 16S rRNA 的基因序列进行 鉴定，可以确定该菌种属于胶质芽孢杆菌，同源度 98%，其 16S rRNA 基因序列在 GenBank 中登陆号 为 [EU781523]. 对菌株先后在含铝硅酸盐矿物 (纯 高岭石、铝土矿原矿) 的该类菌种专性培养基 [10,13] 中分别进行驯化培养. HJ07 菌株的最佳生长条件 为：初始 pH 值为 7.0，培养温度为 28∼30 ℃，摇床 转速为 150∼200 r·min−1 . 在装有 90 mL 培养基的 250 mL 的锥型瓶中，加入 675 µm (–200 目) 纯高

·1270 北京科技大学学报 第35卷 岭石矿样5g,培养7d后，上清液中SiO2的质量 隔1d取上清液样测定SiO2的质量浓度：菌株的 浓度可达到50mgL-1左右，表明该菌株具有较高 生长稳定期通过对细菌在装有不含矿样的纯发酵液 的分解铝硅酸盐矿物能力，并能释放其中的硅 体培养基的锥型瓶，在以上同样条件下培养测定. 1.3细菌诱变与筛选 诱变菌株的遗传稳定性测定：将筛选出的相对 实验菌株在胶质芽孢杆菌改性培养基（专性培 较高脱硅能力的菌株在含铝土矿的液体培养基中连 养基+(NH4)2SO4)中扩大培养至对数生长期，将菌 续培养7代，并分别于第1代、第4代、第7代测 液在5000r~min-1条件下离心分离20min,去上清 定培养液中的SO2的质量浓度，考察诱变菌株脱 液，收集菌体，然后用无菌水制备成菌悬浮液，菌 硅能力的稳定性 体数量控制在107~10°mL-1 1.4铝土矿细菌浸矿实验 紫外(UV)诱变：将制备好的菌悬浮液进行梯 在250mL锥型瓶中装入90mL的胶质芽孢 度稀释，然后各取1L涂布于固体培养基平板 杆菌专性培养基，接入对数生长期未诱变的HJ07 上，30℃下静置培养直至长出菌落，选取平板上 菌株菌液与诱变后H,J07菌株菌液（细菌初始浓度 菌落数为100200的稀释浓度作为最佳稀释浓度. 1×106mL-1),矿浆质量浓度45gL-1，在30℃、 取最佳稀释浓度的菌悬液进行平板涂布后，将放入 初始pH值为7.0、转速为200rmin-1条件下连续 该平板的培养皿中置于距30W紫外灯30cm处分 培养12d,定期测定上清液中的细菌数量、pH值、 别照射30、60、120、180和240s,照射结束后立即 黏度与SO2的质量浓度 将诱变菌液在4℃下避光保存12h.同时，设立未 1.5测试方法 经紫外线照射的HJ07菌株作为平行对照组.将实 上清液中SiO2的浓度采用硅钼蓝分光光度法 验组与对照组平板均在30℃条件下静置培养20h, (721E分光光度仪)测定：pH值用PHS-3C型pH计 观察实验组与对照组平板菌落数，实验组再生菌落 测定：浸矿上清液黏度用黏度计测定，仪器型号为 计数为N,对照组再生菌落计数为M,计算诱变致 NDJ-4:细菌培养液及浸矿上清液中的细菌数量在 死率 XS-212生物显微镜下用平板计数法测定：对细菌浸 a =M-N 出12d后的铝土矿浸渣用20%烧碱溶液和去离子 ×100%. M 水进行清洗，目的清除吸附在浸渣表面的细菌聚集 亚硝基胍(NTG)诱变：取菌悬浮液10mL,分 体及黏性大分子代谢产物，然后用扫描电镜(SEM) 别加入装有90mL含不同质量浓度(0、300、500、600 与能谱(EDS)观察细菌浸出前后铝土矿的表面微观 和700mgL-1)NTG的改性培养基的250mL锥型 形态变化：浸矿培养12d后，从浸出液下部取一滴 瓶中，在30℃、200rmin-1条件下处理40min,然 细菌-矿物复合体样品置于直径5mm的载玻片上， 后离心分离，并用无菌水洗涤三次，除去NTG,终 在超净工作台中自然晾干后（目的是保留浸渣表面 止诱变.然后取各诱变菌液1mL稀释涂布于改性 的生物聚集体与生物膜)，用扫描电镜分析细菌- 培养基琼脂平板上，30℃下培养48h后进行菌落 矿物相互作用过程中表面微观形态：将少量干燥矿 计数，计算致死率，确定最佳诱变剂量并挑取该诱 样样品放在研钵中研磨到粒度为74m,然后进行 变剂量下的菌落进行筛选 X射线衍射（日本Rigaku D/Max-RB型X射线衍 诱变菌株的筛选：①初筛.将HJ07菌株经紫外 射仪)定性分析样品中的矿物组成，并用“K”值 与NTG诱变后且致死率在70%90%的菌液进行后 法【计算出样品中各主要矿物的质量分数：铝土 培养，挑选其中出现较早、生长速度较快且形态不 矿细菌脱硅效率(e)的计算公式为 同的再生菌落接种于琼脂平板上，30℃培养48h, A 长出菌落后，与未经诱变的出发菌株的菌落形态进 e=B×100%. 行比较，选取直径与圆润度比出发菌株更大的菌株 式中，A为浸出液中SO2总质量，B为相同质量原 进一步复筛.②复筛.H07菌株的正突变率由传代 矿样中SiO2总质量. 时间或生长稳定期与对铝硅酸盐矿物的脱硅效率共 2结果与讨论 同确定.菌株的传代时间按照文献[28]方法确定： 菌株的脱硅效率通过装有90L胶质芽孢杆菌改 2.1紫外照射时间与NTG诱变剂质量浓度的确定 性培养基+5g高岭土矿粉的250mL锥型瓶中进 采用不同的紫外线照射时间与不同浓度NTG 行培养测定，实验条件同1.2节.在培养过程中，每 诱变剂对菌株HJ07进行诱变处理，所得菌株的致

· 1270 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 岭石矿样 5 g，培养 7 d 后，上清液中 SiO2 的质量 浓度可达到 50 mg·L −1 左右，表明该菌株具有较高 的分解铝硅酸盐矿物能力，并能释放其中的硅. 1.3 细菌诱变与筛选 实验菌株在胶质芽孢杆菌改性培养基 (专性培 养基 +(NH4)2SO4) 中扩大培养至对数生长期，将菌 液在 5000 r·min−1 条件下离心分离 20 min，去上清 液，收集菌体，然后用无菌水制备成菌悬浮液，菌 体数量控制在 107 ∼108 mL−1 . 紫外 (UV) 诱变：将制备好的菌悬浮液进行梯 度稀释，然后各取 1 mL 涂布于固体培养基平板 上，30 ℃下静置培养直至长出菌落，选取平板上 菌落数为 100∼200 的稀释浓度作为最佳稀释浓度. 取最佳稀释浓度的菌悬液进行平板涂布后，将放入 该平板的培养皿中置于距 30 W 紫外灯 30 cm 处分 别照射 30、60、120、180 和 240 s，照射结束后立即 将诱变菌液在 4 ℃下避光保存 12 h. 同时，设立未 经紫外线照射的 HJ07 菌株作为平行对照组. 将实 验组与对照组平板均在 30 ℃条件下静置培养 20 h， 观察实验组与对照组平板菌落数，实验组再生菌落 计数为 N，对照组再生菌落计数为 M，计算诱变致 死率 α = M − N M × 100%. 亚硝基胍 (NTG) 诱变：取菌悬浮液 10 mL，分 别加入装有 90 mL 含不同质量浓度 (0、300、500、600 和 700 mg·L −1 ) NTG 的改性培养基的 250 mL 锥型 瓶中，在 30 ℃、200 r·min−1 条件下处理 40 min，然 后离心分离，并用无菌水洗涤三次，除去 NTG，终 止诱变. 然后取各诱变菌液 1 mL 稀释涂布于改性 培养基琼脂平板上，30 ℃下培养 48 h 后进行菌落 计数，计算致死率，确定最佳诱变剂量并挑取该诱 变剂量下的菌落进行筛选. 诱变菌株的筛选：①初筛. 将 HJ07 菌株经紫外 与 NTG 诱变后且致死率在 70%∼90%的菌液进行后 培养，挑选其中出现较早、生长速度较快且形态不 同的再生菌落接种于琼脂平板上，30 ℃培养 48 h， 长出菌落后，与未经诱变的出发菌株的菌落形态进 行比较，选取直径与圆润度比出发菌株更大的菌株 进一步复筛. ②复筛. HJ07 菌株的正突变率由传代 时间或生长稳定期与对铝硅酸盐矿物的脱硅效率共 同确定. 菌株的传代时间按照文献 [28] 方法确定； 菌株的脱硅效率通过装有 90 mL 胶质芽孢杆菌改 性培养基 +5 g 高岭土矿粉的 250 mL 锥型瓶中进 行培养测定，实验条件同 1.2 节. 在培养过程中，每 隔 1 d 取上清液样测定 SiO2 的质量浓度；菌株的 生长稳定期通过对细菌在装有不含矿样的纯发酵液 体培养基的锥型瓶，在以上同样条件下培养测定. 诱变菌株的遗传稳定性测定：将筛选出的相对 较高脱硅能力的菌株在含铝土矿的液体培养基中连 续培养 7 代，并分别于第 1 代、第 4 代、第 7 代测 定培养液中的 SiO2 的质量浓度，考察诱变菌株脱 硅能力的稳定性. 1.4 铝土矿细菌浸矿实验 在 250 mL 锥型瓶中装入 90 mL 的胶质芽孢 杆菌专性培养基，接入对数生长期未诱变的 HJ07 菌株菌液与诱变后 HJ07 菌株菌液 (细菌初始浓度 1×106 mL−1 )，矿浆质量浓度 45 g·L −1，在 30 ℃、 初始 pH 值为 7.0、转速为 200 r·min−1 条件下连续 培养 12 d，定期测定上清液中的细菌数量、pH 值、 黏度与 SiO2 的质量浓度. 1.5 测试方法 上清液中 SiO2 的浓度采用硅钼蓝分光光度法 (721E 分光光度仪) 测定；pH 值用 PHS-3C 型 pH 计 测定；浸矿上清液黏度用黏度计测定，仪器型号为 NDJ-4；细菌培养液及浸矿上清液中的细菌数量在 XS-212 生物显微镜下用平板计数法测定；对细菌浸 出 12 d 后的铝土矿浸渣用 20%烧碱溶液和去离子 水进行清洗，目的清除吸附在浸渣表面的细菌聚集 体及黏性大分子代谢产物，然后用扫描电镜 (SEM) 与能谱 (EDS) 观察细菌浸出前后铝土矿的表面微观 形态变化；浸矿培养 12 d 后，从浸出液下部取一滴 细菌 - 矿物复合体样品置于直径 5 mm 的载玻片上， 在超净工作台中自然晾干后 (目的是保留浸渣表面 的生物聚集体与生物膜)，用扫描电镜分析细菌 - 矿物相互作用过程中表面微观形态；将少量干燥矿 样样品放在研钵中研磨到粒度为 74 µm，然后进行 X 射线衍射 (日本 Rigaku D/Max-RB 型 X 射线衍 射仪) 定性分析样品中的矿物组成，并用 “K” 值 法 [10] 计算出样品中各主要矿物的质量分数；铝土 矿细菌脱硅效率 (ε) 的计算公式为 ε = A B × 100%. 式中，A 为浸出液中 SiO2 总质量，B 为相同质量原 矿样中 SiO2 总质量. 2 结果与讨论 2.1 紫外照射时间与 NTG 诱变剂质量浓度的确定 采用不同的紫外线照射时间与不同浓度 NTG 诱变剂对菌株 HJ07 进行诱变处理，所得菌株的致

第10期 孙德四等：胶质芽孢杆菌HJ07的UV与NTG诱变育种及其对铝土矿浸矿效果 .1271· 死率与正突变率结果见表1.从表1可以看出，出 度为600mgL-1时，菌株的致死率分别为89%与 发菌株的致死率与紫外线照射时间及NTG诱变剂 90%,正突变率分别为16.5%与18.7%.因此，紫外 质量浓度存在明显的正效应关系，即随着照射时间 线照射时间与NTG诱变剂质量浓度控制在120s 或诱变剂质量浓度的增加，菌株的致死率逐渐升高， 与600mgL1时，可以达到预期的菌株致死率与 当紫外线照射时间为120s与NTG诱变剂质量浓 正突变率指标 表1紫外照射时间和NTG诱变剂质量浓度对HJ07菌株致死率和正突变率的影响 Table 1 Effects of UV irradiation time and the mass concentration of NTG mutagenic agent on the kill rate and the positive mutation rate of Bacillus mucilaginosus HJ07 诱变方式 UV诱变/s NTG诱变/(mgL-1) 30 60 120 180 240 300 500 600 700 致死率/% 45 75 89 98 100 35 68 90 100 正突变率/% 56.3 45.9 16.5 10.0 0 61.2 25.3 18.7 0 2.2高脱硅效率菌株的筛选 NTG诱变初筛后的各5株诱变菌株进行摇瓶脱硅 将在最佳诱变条件分别进行UV诱变与NTG 活性与生长实验，确定各菌株达到生长稳定其所需 诱变后的HJ07再生菌株（图1(b)、图1(d)分别接 的时间及在7d浸出时间内各培养液中SO2的质 种于胶质芽孢杆菌筛选培养基平板上，30℃培养直 量浓度，结果见表2.表2结果表明，经紫外诱变复 到长出菌落，选取生长速度较快、菌落形态各异且 筛所得的菌株UV-2、UV-3、UV-4与经NTG诱变 变色圈与菌落直径比出发菌株HJ07大的一批菌株 复筛所得菌株NTG-1、NTG-5较出发菌株HJ07达 进入复筛（图1(c)、图1(e). 到生长稳定期所需的时间更短，且具有更高的溶硅 诱变菌株的正突变指标可以用细菌达到生长活性.故选取以上菌株进行进一步的遗传稳定性实 稳定期所需的时间及溶硅效率来衡量.将经UV与 验，确定最佳的浸矿诱变菌株 (a) (b) (c) (d) (e) 图1HJO7菌株诱变前(a、UV诱变后(b以、UV诱变后培养(c、NTG诱变后(d)和NTG诱变后培养(e)的菌落形态 Fig.1 Colonial morphologies of HJ07 strain before mutation (a),HJ07 strain mutated by UV before (b)and after culturing (c),HJ07 strain mutated by NTG before(d)and after culturing (e)

·1272 北京科技大学学报 第35卷 2.3诱变菌株遗传稳定性实验 量浓度相比（分别为49.50、57.85和49.23mgL-1), 将获得的5株脱硅效果较好的诱变菌株UV- 连续培养7代后，浸出上清液中SO2的质量浓度均 2、UV-3、UV-4、NTG-1和NTG-5与出发菌株HJ07 明显降低（分别为47.25、53.75和47.81mgL-1),说 分别转接到液体培养基中，连续培养7代，分别测 明诱变菌株UV-3、UV-4与NTG-1的浸矿脱硅的遗 定第1代、第4代与第7代的各菌株上清液中SiO2 传性能不稳定：UV-2与NTG-5各代菌株浸出上清 的质量浓度，结果见表3.由表3可知：诱变前HJ07 液中SiO2的质量浓度变化幅度较小，分别为50和 菌株的脱硅能力最低，浸出液中SO2的质量浓度 49mgL-1左右，说明诱变菌株UV-2与NTG-5的 为40mgL-1左右：诱变菌株UV-3、UV-4和NTG-1 浸矿脱硅的遗传性能稳定.故确定UV-2与NTG-5 脱硅能力较出发菌株HJ07有较大提高，但与UV- 为浸矿脱硅菌株 3、UV-4和NTG-1的第1代菌株上清液中SiO2的质 表2UV及NTG诱变后菌株、原菌株(CK)的生长稳定期与脱硅能力 Table 2 Growth stable phases and desiliconization capability of UV and NTG mutant strains and the original strain(CK) 菌株 CK UV-1 UV-2 UV-3 UV-4 UV-5 NTG-1 NTG-2 NTG-3 NTG-4 NTG-5 稳定期/h 9690 727868 84 78 82 90 84 72 Si02质量浓度/(mgL-1)40.048.250.650.258.345.6 49.7 46.8 45.5 46.3 48.7 表3不同诱变菌株培养不同代后上清液中SO2的质量浓度遗传稳定性测定结果 Table 3 Genetic stability results of SiO2 mass concentration in leachates of different mutant strains after culturing different generations 菌株 HJ07 UV-2 UV-3 UV-4 NTG-1 NTG-5 第1代菌株上清液中SiO2的质量浓度/(mgL-1) 40.20 50.46 49.50 57.85 49.23 48.55 第4代菌株上清液中SiO2的质量浓度/(mgL-1) 40.67 50.60 48.56 54.26 48.26 48.75 第7代菌株上清液中SiO2的质量浓度/(mg-L-1) 40.78 50.79 47.25 53.75 47.81 49.13 2.4诱变菌株对铝土矿的浸出效果 质量浓度随时间的变化曲线.从图3可以看出，在 用UV-2、NTG-5和出发菌株HJ07浸出铝土 整个浸出过程中，浸出液中SO2的质量浓度随浸 矿，实验测定了浸出过程中各细菌的生长曲线及浸 出时间的变化规律大致可以分为持续快速增加期、 出液的pH值、黏度与SiO2的质量浓度. 平缓增加期与停滞期三个阶段，但在不同的浸出体 系中，SO2质量浓度的增加幅度与进入稳定期的时 图2为浸矿体系中实验菌株细菌数量(N)的 间有所差异.接种了出发菌株HJ07的浸出体系中， 对数随时间的增长情况.图2结果表明，出发菌株 HJ07经过紫外与NTG诱变后，诱变菌株在浸矿体 9.0 系中的生长速度与细菌数量明显要比出发菌株的快 8.5 和大，H07、UV-2和NTG-5分别培养7、5和6d 后进入生长稳定期，浸出12d后，UV-2与NTG-5 8.0 的细菌浓度要比HJ07高一个数量级左右，说明诱 7.5 变菌种能更适应于浸矿环境.与在纯液体发酵培养 0 ◆一HJ07 基中的细菌稳定期（表2）比较，各实验菌株达到生 7.0 ●-NTG-5 长稳定期的时间均有所延长，主要原因是浸矿体系 ▲一UV-2 培养基中无氮源且含有对细菌生长有抑制作用的微 6.5 量重金属元素.实验研究表明：氨源有利于促进细 菌的生长，但该类菌种在有氮培养体系中产酸与产 6.0 567 89101112 多糖的能力明显要比在无氮矿物培养体系中的能力 时间/d 弱，而浸出体系中细菌所产生的代谢产物是矿物降 解风化的关键因素之一 图2采用不同实验菌株浸矿时细菌的生长曲线 Fig.2 Bacterial growth curves when different experimental 图3为采用不同菌株浸矿后浸出液中SO2的 strains were used to leach minerals

· 1272 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 2.3 诱变菌株遗传稳定性实验 将获得的 5 株脱硅效果较好的诱变菌株 UV- 2、UV-3、UV-4、NTG-1 和 NTG-5 与出发菌株 HJ07 分别转接到液体培养基中，连续培养 7 代，分别测 定第 1 代、第 4 代与第 7 代的各菌株上清液中 SiO2 的质量浓度，结果见表 3. 由表 3 可知：诱变前 HJ07 菌株的脱硅能力最低，浸出液中 SiO2 的质量浓度 为 40 mg·L −1 左右；诱变菌株 UV-3、UV-4 和 NTG-1 脱硅能力较出发菌株 HJ07 有较大提高，但与 UV- 3、UV-4 和 NTG-1 的第 1 代菌株上清液中 SiO2 的质 量浓度相比 (分别为 49.50、57.85 和 49.23 mg·L −1 )， 连续培养 7 代后，浸出上清液中 SiO2 的质量浓度均 明显降低 (分别为 47.25、53.75 和 47.81 mg·L −1 )，说 明诱变菌株 UV-3、UV-4 与 NTG-1 的浸矿脱硅的遗 传性能不稳定；UV-2 与 NTG-5 各代菌株浸出上清 液中 SiO2 的质量浓度变化幅度较小，分别为 50 和 49 mg·L −1 左右，说明诱变菌株 UV-2 与 NTG-5 的 浸矿脱硅的遗传性能稳定. 故确定 UV-2 与 NTG-5 为浸矿脱硅菌株. 表 2 UV 及 NTG 诱变后菌株、原菌株 (CK) 的生长稳定期与脱硅能力 Table 2 Growth stable phases and desiliconization capability of UV and NTG mutant strains and the original strain (CK) 菌株 CK UV-1 UV-2 UV-3 UV-4 UV-5 NTG-1 NTG-2 NTG-3 NTG-4 NTG-5 稳定期/h 96 90 72 78 68 84 78 82 90 84 72 SiO2 质量浓度/(mg·L−1 ) 40.0 48.2 50.6 50.2 58.3 45.6 49.7 46.8 45.5 46.3 48.7 表 3 不同诱变菌株培养不同代后上清液中 SiO2 的质量浓度遗传稳定性测定结果 Table 3 Genetic stability results of SiO2 mass concentration in leachates of different mutant strains after culturing different generations 菌株 HJ07 UV-2 UV-3 UV-4 NTG-1 NTG-5 第 1 代菌株上清液中 SiO2 的质量浓度/(mg·L−1 ) 40.20 50.46 49.50 57.85 49.23 48.55 第 4 代菌株上清液中 SiO2 的质量浓度/(mg·L−1 ) 40.67 50.60 48.56 54.26 48.26 48.75 第 7 代菌株上清液中 SiO2 的质量浓度/(mg·L−1 ) 40.78 50.79 47.25 53.75 47.81 49.13 2.4 诱变菌株对铝土矿的浸出效果 用 UV-2、NTG-5 和出发菌株 HJ07 浸出铝土 矿，实验测定了浸出过程中各细菌的生长曲线及浸 出液的 pH 值、黏度与 SiO2 的质量浓度. 图 2 为浸矿体系中实验菌株细菌数量 (N) 的 对数随时间的增长情况. 图 2 结果表明，出发菌株 HJ07 经过紫外与 NTG 诱变后，诱变菌株在浸矿体 系中的生长速度与细菌数量明显要比出发菌株的快 和大，HJ07、UV-2 和 NTG-5 分别培养 7、5 和 6 d 后进入生长稳定期，浸出 12 d 后，UV-2 与 NTG-5 的细菌浓度要比 HJ07 高一个数量级左右，说明诱 变菌种能更适应于浸矿环境. 与在纯液体发酵培养 基中的细菌稳定期 (表 2) 比较，各实验菌株达到生 长稳定期的时间均有所延长，主要原因是浸矿体系 培养基中无氮源且含有对细菌生长有抑制作用的微 量重金属元素. 实验研究表明：氮源有利于促进细 菌的生长，但该类菌种在有氮培养体系中产酸与产 多糖的能力明显要比在无氮矿物培养体系中的能力 弱，而浸出体系中细菌所产生的代谢产物是矿物降 解风化的关键因素之一. 图 3 为采用不同菌株浸矿后浸出液中 SiO2 的 质量浓度随时间的变化曲线. 从图 3 可以看出，在 整个浸出过程中，浸出液中 SiO2 的质量浓度随浸 出时间的变化规律大致可以分为持续快速增加期、 平缓增加期与停滞期三个阶段，但在不同的浸出体 系中，SiO2 质量浓度的增加幅度与进入稳定期的时 间有所差异. 接种了出发菌株 HJ07 的浸出体系中， 图 2 采用不同实验菌株浸矿时细菌的生长曲线 Fig.2 Bacterial growth curves when different experimental strains were used to leach minerals