HOX 14-4 TABLE 1 Antibiotics: Targets and Consequences Antibiotic/Toxin Target Cells Molecular Target Consequence le tracycline Prokaryotic cells A site of 30s subunit hibits aminoacyl-trna binding to the a site I hygromycin B rokaryotic and Near the A site of 30S Prevents translocation of A-site trNa to subunit pUromycin Prokaryotic cells Adjacent to the A site Increases error rate during translation by decreasing selectivity of codon-anticodon site in 30S subunit Chioramphenicol Prokaryotic cells Peptidyl transferase Blocks correct positioning of the A site enter of 50S subunit aryotic and Peptidyl transferase Chain terminator; mimics the 3 end of ukaryotic cells center of large aminoacyl-tRNA in A site and acts as acceptor for the nascent polypeptide chain unne Blocks exit of the growing polypeptide chain Fusidic acid Prokaryotic cells EF-G Prevents release of EF-G-GDP from Thiostrepton Prokaryotic cells Factor binding center of the iation of IF2 and EF-G 50S subunit with factor binding center Kirromycin associated with gtP hydrolysis and e EF-tu Ricin and cx Chemically modifies the RNa Prevents activation of translation factor eukaryotic cells n the factor binding center of large ribosomal subunit Diptheria Toxin Eukaryotic cells Chemically modifies EF-Tu Inhibits EF-Tu function Cycloheximide Eukaryotic cells eptidyl transferase Inhibits peptidyl transferase activity center of the 60S subunit (from Molecular Biology of Gene(Fifth Edition, 2004). PP 453)
(from Molecular Biology of Gene (Fifth Edition,2004).PP.453)
②遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。 常用的遗传标记及检测方法 管养标记 划线或影印平板菌落于具有或不具有待检测的营养成分但含有其他各种必需的营养成分 的平板上 杭生素抗性标记 划线或影印平板菌落于含有或不含有某种抗生素的平板上 其他标记 在含有Xgl和IPTG的LB平板上划线培养细菌(见1.4),lacz+菌落应该变蓝,而对照菌 株(lacz-)则不应变蓝 lacZ△M15b 用pUC质粒和对照质粒如pBR322转化大肠杆菌,将转化体划线于含有Xgal和IPrG的 氨苄抗性LB平板上,pUC质粒转化的菌落应该变蓝,而对照质粒如pBR322转化的菌落不 应变蓝 F+或F 将M13噬菌体涂布细菌层面上应该看到小的噬菌斑(见1.15) rec 用一根牙签在LB平板上划一条水平线,同法将recA+对照菌也划一条水平线,然后用一纸 板遮住平板的一半,用手提紫外灯在254m紫外光下以3×10-5/m2照射平板(通常紫 外灯离平板50cm照射20s)。reA-细菌对紫外线十分敏感,没有被纸板遮住的recA-细 菌应被这一水平的射线杀死 recBCD 将gam稀释液和λgam+稀释液并排点在细菌层,二者应该形成大小几乎相同的噬菌斑
② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因
hsds (1)用来自于hsdS或者hsdRˉ宿主菌的不同的稀释度的λ噬菌体感染寒变菌株和野生型 菌株。如果噬菌体来自于hsdS一宿主菌,那么它在hsdS_菌株中形成噬菌斑的效率比在 野生型菌株中形成噬菌斑的效率要高104到10倍,如果是来自hdR-(hsdS+hsaM+) 宿主菌,那么二者形成噬斑的效率应该是一样的 (2)重悬一个源于假设的 hsds-菌株的新鲜噬菌斑于1mLλ噬菌体稀释缓冲液中,用 hsdS-菌株和野生型菌株滴定λ噬菌体悬液,在hsdS-菌株上形成的噬斑数目应该比 野生型菌株高104到106倍,每个噬斑约有107个噬菌体 hsdR-(hsdS+hsdM+)(1)同以上步骤(1),只是噬菌体来源于hdS-宿主菌 2)重悬一个新鲜噬菌斑于1mLλ噬菌体稀释缓冲液中,在hdR-菌株和野生型菌株上进 行滴定,二者形成噬斑的效率应该一样 dam 用带有Mb1和B!I酶切位点的质粒,转化该菌株和野生型菌株,从两菌株中提取质粒 来自dam-菌株的质粒仍能被Mb和BclI识别 用带有 ScrF I酶切位点的质粒转化该菌株和野生型菌株,从两菌株中提取质粒用 ScrF I 酶切鉴定。只有源于dm菌株的质粒才会被完全切开,即使是DNA被dm甲基化,仍有 一半的 ScrF I位点可被切开 在LB平板上划线培养单菌落同时用野生菌株划线培养作为对照,于37℃培养,om菌株 克隆应该较大,发亮并且有粘性 a.表中所用的方法涉及培养基的准备(见1.1),在平板上的划线和影印培养(见1.3)以及λ噬菌体来源的载体的 操作。 b编码半乳糖苷酶的n片段
抗菌素选择原理 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗 菌素的培养基(选择培养基)中生长。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后, 受体菌才能生长 抗性基因 死 活 抗菌素
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后， 受体菌才能生长。 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗 菌素的培养基（选择培养基）中生长。 • 抗菌素选择原理 死 活 抗性基因 抗菌素
人工构建的质粒载体的类型 ①高拷贝数的质粒载体 co1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下(蛋白 质合成抑制剂,氯霉素等存在下)仍能复制, 达到每个细胞的拷贝数10003000个! 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的 基因产物
(4) 人工构建的质粒载体的类型 ① 高拷贝数的质粒载体 ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白 质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制， 达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的 基因产物