*部分重叠 如： K和C *两个基因共用少数 碱基对 如： D和J -TAATG- D 终止密码子 J 起始密码子
*部分重叠 如： K和C *两个基因共用少数 碱基对 如： D和J -TAATG- D 终止密码子 J 起始密码子
3. DNA测序的方法 ◼ 链终止法测序 ◼ 化学降解法测序 ◼ 自动化测序 ◼ 非常规DNA测序
3. DNA测序的方法 ◼ 链终止法测序 ◼ 化学降解法测序 ◼ 自动化测序 ◼ 非常规DNA测序
3.1 链终止法测序(the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止反 应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而 来读取待测DNA分子的顺序
3.1 链终止法测序(the chain termination method) 基本原理: 通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链， 由于合成的互补链可在不同位置随机终止反 应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而 来读取待测DNA分子的顺序
技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA A 高酶活性 B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性 ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连接 的是氢原子,不是羟基
技术路线与要求 制备单链模板 ↓ 将单链模板与一小段引物退火 ↓ 加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸 分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓ 将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓ 根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列 A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA C 噬粒克隆DNA D PCR产生单链DNA A 高酶活性 B 无5’→3´外切酶活性 C 无3´→5´外切酶活性 ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连接 的是氢原子,不是羟基
5￥ 模板 : TAGCAACT 习引物 DNA 浆合到+ dATP dATP dATP dATP+ddATP dGTP GIP dGTP+ddGTP dGTP dCTP dCTP+ddCTP dCTP dCTP dTTP+doTTP dTTP dTTp UTTP ! -ATCGTddT -ATddC -ATCGTTddG -ATCGTTGddA ATCGddT -ATCddG ddA ·AddI