由于6号管浓度较大,显色后颜色太深,测量不准,偏离吸收定律较大,所以往往只做 到5号,应使测量值在02~06范围内 解释: (1)为什么酪氨酸要干燥至恒重? 在此酪氨酸作为基准物,所以应干燥至恒重,防止含有水份带来误差 (2)为什么称取酪氨酸的量为0.1000g? 为了作图描点在轴上好表示,故希望系列浓度取整数,这样更准确,故称取酪氨酸的量 应为0.100g,减少误差 (3)为什么酪氨酸用盐酸溶解? 凡有需制作标准曲线的实验,为了减少误差,总是尽可能的使制作标准曲线时的条件与 实际测定条件一致,消除因条件差异所带来的误差,提高测定准确度。酪氨酸是两性物质, 酸碱均可用溶,而为什么在此用盐酸不用碱呢?正是考虑上述原因,因为酶催化酪蛋白水解 反应是用来终止的,酪蛋白水解的酪氨酸是处在酸性介质中的,用酸溶解刚好前后介 质一致 3.系列浓度的酪氨酸显色并测OD值 从上述配制的系列浓度的酪氨酸标准溶液中各移取Im于干试管中分别加 5m0.55mol/LNa2CO3,福林试剂lm,摇匀放入40℃水浴上显色10分钟,应显蓝色,冷却 到室温。用0号管调零,1cm的比色皿,680nm波长下测OD值。 说明: (1)所加各试剂均用刻度移液管移取,保证体积一至 (2)显色后需冷却到室温,因为K值受温度的影响。 (3)每一个点均测两份平行试样,误差△OD≤001,这样算来共用3×6=18支干试 管 4.描点作图 (1)画图求直线斜率的倒数K 应为一条过原点的直线。各点OD取平均试样的平均值,为了便于后面计算。应求出 K=△C/△OD(g/m1/0D 即OD为一个单位时所相当的酪氨酸浓度 OD △OD 0.2 △C 01020304050C(4g/m) (2)计算求K 根据各点所测平均OD分别求出K=C/OD取K=(K1+K2+K3+K4+K5)/5 3)直接查取
由于 6 号管浓度较大，显色后颜色太深，测量不准，偏离吸收定律较大，所以往往只做 到 5 号，应使测量值在 0.2～0.6 范围内。 解释： （1）为什么酪氨酸要干燥至恒重？ 在此酪氨酸作为基准物，所以应干燥至恒重，防止含有水份带来误差。 （2）为什么称取酪氨酸的量为 0.1000g？ 为了作图描点在轴上好表示，故希望系列浓度取整数，这样更准确，故称取酪氨酸的量 应为 0.1000g，减少误差。 （3）为什么酪氨酸用盐酸溶解？ 凡有需制作标准曲线的实验，为了减少误差，总是尽可能的使制作标准曲线时的条件与 实际测定条件一致，消除因条件差异所带来的误差，提高测定准确度。酪氨酸是两性物质， 酸碱均可用溶，而为什么在此用盐酸不用碱呢？正是考虑上述原因，因为酶催化酪蛋白水解 反应是用 来终止的，酪蛋白水解的酪氨酸是处在酸性介质中的，用酸溶解刚好前后介 质一致。 3．系列浓度的酪氨酸显色并测 OD 值 从上述配制的系 列浓度 的酪氨 酸标准 溶液中 各移取 1ml 于干 试管中 分别加 5ml0.55mol/L Na2CO3，福林试剂 1ml，摇匀放入 40℃水浴上显色 10 分钟，应显蓝色，冷却 到室温。用 0 号管调零，1cm 的比色皿，680nm 波长下测 OD 值。 说明： （1）所加各试剂均用刻度移液管移取，保证体积一至。 （2）显色后需冷却到室温，因为 K 值受温度的影响。 （3）每一个点均测两份平行试样，误差ΔOD≤0.01，这样算来共用 3×6＝18 支干试 管。 4．描点作图 （1）画图求直线斜率的倒数 K 应为一条过原点的直线。各点 OD 取平均试样的平均值，为了便于后面计算。应求出 K=ΔC/ΔOD（μg/ml OD） 即 OD 为一个单位时所相当的酪氨酸浓度。 （2）计算求 K 根据各点所测平均 OD 分别求出 K=C/OD 取 K=（K1+K2+K3+K4+K5）/5 （3）直接查取
OD C被测 c(ug/ml) (4)电脑做图、计算、使用 四种方法均可使用,道理都一样。 标准曲线所用仪器不同,试剂不同或其它条件的不同均会引起变动。故应定期校正。更 换仪器、更换试剂。标准曲线应重新制作。同样实测应与制作标准曲线条件一致。仪器、试 剂、比色皿厚度、操作等 注意:直线应落在一群点的中间,同时纵横坐标的比例,使直线处于坐标系的中间。 (二)测定蛋白酶活力一一实测 1.底物配制 反应 0.5%2% 测定酸性蛋白酶(如537)0.5%酪素配制 称取酪素0.5g,加入约50mlPH=3.0的缓冲溶液搅匀调溶,然后在沸水中加热,到清晰 透明冷却后再以上述缓冲溶液定容到100m,若有泡沫,可加1~2滴无水酒精消除。置于 4℃的冰箱中保存,超过5天另外配制 测定碱性蛋白酶(如2709)或中性蛋白酶(如1398)0.5%酪素配制 0.5g酪素不必太精确,工业大平即可,(多点少点没关系)于小烧杯中,用0.5 MNaoh润 涨加相应的缓冲溶液,在沸水浴上溶解(透明液体),冷却,用精密试纸检査调节PH为测酶 的最适PH,(如PH=10:PH=75)然后用相应的缓冲溶液定容到100ml,置于4℃的冰箱中 保存,超过5天另外配制 2.配置待测酶液 精称酶粉0.5g加数滴缓冲溶液研磨5(潮湿为止,再加数滴缓冲液再磨5,加缓冲液 搅拌均匀、沉降,转移上层清液。如此反应3-4次,到酶液及所有残渣均转入容量瓶中,用 缓冲溶液定容到20oml。摇匀过滤(8层干沙布),滤溶液于干烧杯中,吸取滤液10ml,用缓 冲溶液定容到100ml容量瓶中。实测时只需吸取二次定容后的酶液lml那么实际用了所称 量酶的几分之几呢?(即稀释倍数为多少呢) (10/200)×(1/100)=1/2000 故稀释倍数为2000用了酶粉W2000g) 此次操作关键有两点:称量重量与稀释倍数、研磨时间。 (1)稀释倍数与称量重量的原则 是以测定水解时酪氨酸的光密度在04±(0.2-0.4),即0.2-0.6范围之内 称量重量与稀释倍数相互联系,要么固定称量,改变稀释倍数,来测OD。要么固定 稀释倍数改变称量重量,以使OD落在范围内。一次测定时通常是固定称量重量。而改变稀 释倍数,尤其是改变第二次稀释倍数。这样比较方便。多次测定常采用改变称量重量,固定 稀释倍数
（4）电脑做图、计算、使用 四种方法均可使用，道理都一样。 标准曲线所用仪器不同，试剂不同或其它条件的不同均会引起变动。故应定期校正。更 换仪器、更换试剂。标准曲线应重新制作。同样实测应与制作标准曲线条件一致。仪器、试 剂、比色皿厚度、操作等。 注意：直线应落在一群点的中间，同时纵横坐标的比例，使直线处于坐标系的中间。 （二）测定蛋白酶活力——实测 1．底物配制 测定酸性蛋白酶（如 537）0.5﹪酪素配制 称取酪素 0.5g, 加入约 50mlPH=3.0 的缓冲溶液搅匀调溶，然后在沸水中加热，到清晰 透明冷却后再以上述缓冲溶液定容到 100ml，若有泡沫，可加 1～2 滴无水酒精消除。置于 4℃的冰箱中保存，超过 5 天另外配制。 测定碱性蛋白酶（如 2709）或中性蛋白酶（如 1398）0.5﹪酪素配制 0.5g 酪素不必太精确，工业大平即可，(多点少点没关系)于小烧杯中，用 0.5MNaOH 润 涨加相应的缓冲溶液，在沸水浴上溶解(透明液体)，冷却，用精密试纸检查调节 PH 为测酶 的最适 PH,（如 PH=10；PH=7.5）然后用相应的缓冲溶液定容到 100ml，置于 4℃的冰箱中 保存，超过 5 天另外配制。 2．配置待测酶液 精称酶粉 0.5g 加数滴缓冲溶液研磨 5`(潮湿为止)，再加数滴缓冲液再磨 5`，加缓冲液 搅拌均匀、沉降，转移上层清液。如此反应 3~4 次，到酶液及所有残渣均转入容量瓶中，用 缓冲溶液定容到 200ml。摇匀过滤(8 层干沙布)，滤溶液于干烧杯中，吸取滤液 10ml，用缓 冲溶液定容到 100ml 容量瓶中。实测时只需吸取二次定容后的酶液 1ml 那么实际用了所称 量酶的几分之几呢?(即稀释倍数为多少呢) （10/200）×（1/100）=1/2000 故稀释倍数为 2000 用了酶粉 W/2000(g) 此次操作关键有两点：称量重量与稀释倍数、研磨时间。 （1）稀释倍数与称量重量的原则 是以测定水解时酪氨酸的光密度在 0.4±（0.2~0.4），即 0.2~0.6 范围之内。 称量重量与稀释倍数相互联系，要么固定称量，改变稀释倍数，来测 OD。 要么固定 稀释倍数改变称量重量，以使 OD 落在范围内。一次测定时通常是固定称量重量。而改变稀 释倍数，尤其是改变第二次稀释倍数。这样比较方便。多次测定常采用改变称量重量，固定 稀释倍数
(2)研磨时间 酶制剂是粗制品,颗粒大小不均。又有杂质及不溶物混在一起,尤其是填料能吸附一部 分酶体,故需研磨浸提。使酶的活性基团充分暴露出来,故研磨浸提程度不同。基团暴露程 度不同,活力也不同。关键是第一、二次,故用力及时间应力求均衡准确,最后的残渣也占 体积,故需全部转移进去定容 3.测定 酶催化 酪蛋白 酪氨酸 条件 底物酪素液40℃水浴予热。取9支干试管编号,按下表顺序操作,所用试液均用刻度 移液管准确移取。 空白管0 平行管1 平行管2 酶液(ml) 10%三氯乙酸(ml) 酪素(ml) 现象 白色↓ 操作 40℃水浴保温10分钟 10%三氯乙酸(ml) 现象 白色↓ 白色↓ 白色↓ 操作 取出摇振后室温下静置数分钟过滤 接滤液 干试管 0 移取滤液(ml) 0.55M Na2 CO(mD) 福林试剂(ml) 操作 40℃水浴保温10分钟 取出冷却至室温,用空白对照管0¨调零,测1∵、2¨平行管,误差不大于001 解释: (1)三个顺列试管0为空白管,1、2为平行试样管,即一样的东西。0号先加入 CCL3 COOH使酶不能催化酪素水解。而1、2号管使酶作用底物10以后再迅速加入 CCL3 COOH终止反应,故0号一开始就有白色↓,而1、2管10°后加CCL3COOH后产生 白色↓酪素。 (2)为了便于过滤保证滤液透明干净,应使↓沉静片刻颗粒凝聚变大,滤纸应是干燥 的 (3)滤液中所含酪氨酸,即酶催化酪素产生的水解物是处在酸性介质中,与制作标准 曲线一致。 (4)为什么不以蒸馏水为空白呢? 在比色分析中,常需利用空白溶液(又称参比或对照溶液)调节仪器的消光度为0。以消 除显色溶液中其它有色物质的干扰,抵消比色皿和试剂对入射光的影响。常用的空白有三种 蒸馏水空白、试剂空白和平行操作空白。若所用操作试剂无色,对测定没影响。则可用蒸馏 水作空白调零。而我们这次均用了平行操作空白。即没有反应实测的实测。以消除溶剂、各 种试剂、水、器皿和操作条件带入的误差。比如实测时,底物在配制溶液过程中以及以后的 操作中,难免产生微量的水解,或多或少却不可避免。此水解产生的酪氨酸。并非由酶催化 而产生,故应扣除掉这部分。用平行测定空白即上述溶液为空白,即可做到这一点,也可消 除其它因素带来的影响
（2）研磨时间 酶制剂是粗制品，颗粒大小不均。又有杂质及不溶物混在一起，尤其是填料能吸附一部 分酶体，故需研磨浸提。使酶的活性基团充分暴露出来，故研磨浸提程度不同。基团暴露程 度不同，活力也不同。关键是第一、二次，故用力及时间应力求均衡准确，最后的残渣也占 体积，故需全部转移进去定容。 3．测定 酶催化 酪蛋白 酪氨酸 条件 底物酪素液 40℃水浴予热。取 9 支干试管编号，按下表顺序操作，所用试液均用刻度 移液管准确移取。 空白管 0 平行管 1 平行管 2 酶液（ml） 1 1 1 10﹪三氯乙酸（ml） 3 0 0 酪素（ml） 2 2 2 现象 白色↓ 无 无 操作 40℃水浴保温 10 分钟 10﹪三氯乙酸（ml） 0 3 3 现象 白色↓ 白色↓ 白色↓ 操作 取出摇振后室温下静置数分钟过滤 接滤液 1` 1` 2` 干试管 0`` 1`` 2`` 移取滤液（ml） 1 1 1 0.55M Na2CO3（ml） 5 5 5 福林试剂（ml） 1 1 1 操作 40℃水浴保温 10 分钟 取出冷却至室温，用空白对照管 0``调零，测 1``、2``平行管，误差不大于 0.01。 解释： （1）三个顺列试管 0 为空白管，1、2 为平行试样管，即一样的东西。0 号先加入 CCL3COOH 使酶不能催化酪素水解。而 1、2 号管使酶作用底物 10`以后再迅速加入 CCL3COOH 终止反应，故 0 号一开始就有白色↓，而 1、2 管 10`后加 CCL3COOH 后产生 白色↓酪素。 （2）为了便于过滤保证滤液透明干净，应使↓沉静片刻颗粒凝聚变大，滤纸应是干燥 的。 （3）滤液中所含酪氨酸，即酶催化酪素产生的水解物是处在酸性介质中，与制作标准 曲线一致。 （4）为什么不以蒸馏水为空白呢? 在比色分析中，常需利用空白溶液(又称参比或对照溶液)调节仪器的消光度为 0。以消 除显色溶液中其它有色物质的干扰，抵消比色皿和试剂对入射光的影响。常用的空白有三种： 蒸馏水空白、试剂空白和平行操作空白。若所用操作试剂无色，对测定没影响。则可用蒸馏 水作空白调零。而我们这次均用了平行操作空白。即没有反应实测的实测。以消除溶剂、各 种试剂、水、器皿和操作条件带入的误差。比如实测时，底物在配制溶液过程中以及以后的 操作中，难免产生微量的水解，或多或少却不可避免。此水解产生的酪氨酸。并非由酶催化 而产生，故应扣除掉这部分。用平行测定空白即上述溶液为空白，即可做到这一点，也可消 除其它因素带来的影响
所以,空白也是有颜色的,肉眼看不见的浅蓝色。1、2号肉眼所观的颜色深浅应一致, 否则肯定不平行。 (4)前后两个10分钟有什么不同? 前要准确,后可以多,但不可少 五、计算 两份平行试样结果平行后(ΔOD≤0.01)取平均值计算:1g酶粉或1ml酶液每分钟水 解酪蛋白产生酪氨酸的μg数 单位 (KOD6N)/(10W)=(6KODN)/(10W) OD:实测水解底物时所产生酪氨酸的光密度 K:当OD值为1单位时所代表的酪氨酸的浓度(酪氨酸μgmOD) K=C/OD=1/K′ 6:过滤以前水溶液的总体积为6m,酪氨酸就处于体积为6ml的溶液中 N:稀释倍数。在此N=2000 W:酶粉重(g)。 10:反应时间为10分钟 六、注意事项 本次实验属于微量分析,麻烦,细碎,故要特别细心操作,严格控制条件、温度、反应 时间等,否则很难平行,最后在报告中应标明测定条件。 胰酶的测定 概述 1.胰酶的性质 食用动物的新鲜胰脏亠清洗→切碎→脱水干燥→粉碎→脱脂→浸提→干胰酶粉剂 胰酶是白色或黄色的无晶形粉末,有微弱的肉类物臭味,在水中缓缓溶解(但不完全), 不溶于醇和醚中。是从猪、牛、羊等食用动物的胰脏中得到的一种水解酶类,可以促进某些 蛋白质的水解的反应。在中性或弱碱性条件下,即PH=7.8-87活性强。遇到少量无机酸或 大量的碱即降低活性,经煮沸则迅速分解而变性。 2.胰酶在制革生产中的应用 种常用的酶软剂(混合酶类) 胰酶在原料皮脱灰后进行软化。胰酶中所含的弹性蛋白酶,可以分解弹性蛋白质,防止 成革粒面出现碎玻璃花纹,提高产品质量 胰酶软化时,对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解,可除去皮内残存的脏物、毛根分 解产物、纤维间质等,有利于皮纤维进一步分散,促进鞣剂与皮胶原的结合,以使成革具有 柔软性、丰满性和良好的透气性 胰酶中还含有一些脂肪酶可继续脱脂 3.为什么要测定胰酶活力? 酶软化是制造软革很重要的操作,但胰酶浓度过高。皮内胶原纤维损失大,致使成革造 成松面。为了达到正常的软化目的,必须在软化之前,测定含量即活力,以便正确确定其含 4.定义 胰酶能催化酪蛋白水解,而且胰酶量越多,被水解的酪蛋白就越多。一定量的胰酶,促 化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多,其胰酶的活力越大。与蛋白酶活力不同的表示是, 胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。即 在一定的PH和时间内lg胰酶能使酪蛋白完全水解的克数,即胰酶能使酪蛋白转化的 能力。以倍数来计量:×克酪蛋白/g酶粉,叫×倍。出厂胰酶活度一般为25倍 二、测定原理醋酸盐指示剂法(富尔德一哥劳斯法) 控制胰酶的最适条件PH=8~9、T=40±1℃,用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用,水 解一定的时间后,用醋酸盐(或醋酸)指示剂调节反应液PH达到酪蛋白的等电点(PH=46)附 近,未被水解的酪蛋白呈白色沉淀折出,而水解产物则不沉淀。据此,则可找到恰好使定量 的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。根据胰酶的体积和浓度,即可计算出胰酶对酪蛋白的转 化倍数,即胰酶的活力
所以，空白也是有颜色的，肉眼看不见的浅蓝色。1、2 号肉眼所观的颜色深浅应一致， 否则肯定不平行。 （4）前后两个 10 分钟有什么不同？ 前要准确，后可以多，但不可少。 五、计算 两份平行试样结果平行后（ΔOD≤0.01）取平均值计算：1g 酶粉或 1ml 酶液每分钟水 解酪蛋白产生酪氨酸的μg 数。 单位/g =（K·OD·6·N）/（10·W）=（6·K·OD·N）/（10·W） OD：实测水解底物时所产生酪氨酸的光密度 K：当 OD 值为 1 单位时所代表的酪氨酸的浓度（酪氨酸μg/ml/OD） K=C/OD=1/K′ 6：过滤以前水溶液的总体积为 6ml，酪氨酸就处于体积为 6ml 的溶液中。 N：稀释倍数。在此 N=2000 W：酶粉重（g）。 10：反应时间为 10 分钟。 六、注意事项 本次实验属于微量分析，麻烦，细碎，故要特别细心操作，严格控制条件、温度、反应 时间等，否则很难平行，最后在报告中应标明测定条件。 胰酶的测定 一、概述 1．胰酶的性质 食用动物的新鲜胰脏→清洗→切碎→脱水干燥→粉碎→脱脂→浸提→干胰酶粉剂. 胰酶是白色或黄色的无晶形粉末，有微弱的肉类物臭味，在水中缓缓溶解（但不完全）， 不溶于醇和醚中。是从猪、牛、羊等食用动物的胰脏中得到的一种水解酶类，可以促进某些 蛋白质的水解的反应。在中性或弱碱性条件下，即 PH=7.8~8.7 活性强。遇到少量无机酸或 大量的碱即降低活性，经煮沸则迅速分解而变性。 2．胰酶在制革生产中的应用 一种常用的酶软剂（混合酶类） 胰酶在原料皮脱灰后进行软化。胰酶中所含的弹性蛋白酶，可以分解弹性蛋白质，防止 成革粒面出现碎玻璃花纹，提高产品质量。 胰酶软化时，对皮内一些蛋白质进行不同程度的消解，可除去皮内残存的脏物、毛根分 解产物、纤维间质等，有利于皮纤维进一步分散，促进鞣剂与皮胶原的结合，以使成革具有 柔软性、丰满性和良好的透气性。 胰酶中还含有一些脂肪酶可继续脱脂。 3．为什么要测定胰酶活力？ 酶软化是制造软革很重要的操作，但胰酶浓度过高。皮内胶原纤维损失大，致使成革造 成松面。为了达到正常的软化目的，必须在软化之前，测定含量即活力，以便正确确定其含 量。 4．定义 胰酶能催化酪蛋白水解，而且胰酶量越多，被水解的酪蛋白就越多。一定量的胰酶，促 化的酪蛋白越多或生成的分解产物越多，其胰酶的活力越大。与蛋白酶活力不同的表示是， 胰酶活力是用在一定条件下底物的消耗量来表示。即： 在一定的 PH 和时间内 1g 胰酶能使酪蛋白完全水解的克数，即胰酶能使酪蛋白转化的 能力。以倍数来计量：×克酪蛋白/g 酶粉，叫×倍。出厂胰酶活度一般为 25 倍。 二、测定原理;醋酸盐指示剂法（富尔德—哥劳斯法） 控制胰酶的最适条件 PH=8~9、T= 40±1℃，用定量的酪蛋白和不同量的胰酶作用，水 解一定的时间后，用醋酸盐(或醋酸)指示剂调节反应液 PH 达到酪蛋白的等电点(PH=4.6)附 近，未被水解的酪蛋白呈白色沉淀折出，而水解产物则不沉淀。据此，则可找到恰好使定量 的酪蛋白完全水解的最小胰酶用量。根据胰酶的体积和浓度，即可计算出胰酶对酪蛋白的转 化倍数，即胰酶的活力