皮革课程_《皮革生产过程控制分析》结论.doc_P6-P10

（3）酶的化学本质是蛋白质。四级结构及性质。由许多不同种类的氨基酸按一定顺序排列构成的多肽链。具有一、二、三、四级空间结构。激烈振荡、加热、紫外线、X-射线的照射，重金属盐作用，会改变结构。而（失活）变性，失去催化能力，这种现象叫做酶的失活；与 H +、OH+成盐；两性；成色。 2．影响酶催化反应的因素（1）底物浓度底物浓度低，酶的活性中心，没完全和底物结合，因此随底物浓度的增加反应速度加快，当 C↑=C O 饱合浓度时，酶的活性中心和底物作用完全。反应速度达到极限值——最大的反应速度。当 C> CO 增加时，因酶活性中心已被占完再 C↑，对 V 也无影响。故使酶催反应达到最大速度，必须给底物浓度的大约 CO 的作用条件。 Vmax 底物浓度 C 饱和浓度 C0 （2）PH 值的影响酶是蛋白质，属于两性物质，两个极性基。 NH2 NH3 + ∣ ∣ R—C—COOH R—C—COO- ∣ ∣ H H 不同的 PH 值都有不同的离解状态，而不同的离解状态又有不同的活力，而要使酶的活力最大，必需使活性基团处在最佳理解状态，而每一种酶要达到他的最大活力，必须处在它们最佳离解状态。也就是说必须控制一个最适合 PH。每一种酶都有其自己的最适 PH 值。 OD PH 最适 PH 实际应用中可根据酶的最适 PH 值不同将酶分为酸性、中性、碱性蛋白酶。酸性蛋白酶。最适 PH 在酸性范围内。如： 3350 蛋白酶 PH 最适 2～4；7401 蛋白酶 PH 最适 3.0 中性蛋白酶。最适 PH 在中性范围内。如： 1398 PH 最适 7～7.5； 166 PH 最适 7～8 碱性蛋白酶。最适 PH 在碱性范围内。如： 2709 PH 最适 9 ～11； 209 PH 最适 9.5～11 （3）温度的影响。 T↗T 最适速度加快。 OD T 最适 ↗蛋白酶受热失活 V↘。每个酶都有最适温度。一般在 40℃±。 T 最适 T（℃）（4）作用时间的影响 K=dQ/dt 直线

Q(反应物的消耗量或生成物的生成量) t^°V恒定 toV×to一反应初速度时间结论:酶催化反应必须在反应初速度时间内,选择最适温度、最适PH,饱合底物浓度的条件下才能达到最大反应速度,即此时酶的活力最大。对于测定酶活力时,只有这样才能消除诸多因素的影响,比较各种酶活力的大小。(最大活力、可比性)。 3.什么是酶的活力酶催化底物进行反应的本领。酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的反应物量越大,则催化速度越快,活力越高。蛋白酶的活力定义:在一定温度、PH值条件下,1g酶粉或lm酶液,每分钟催化水解酪蛋白(或血红蛋白)所产生的酪氨酸的微克数,称为酶的活力。表示为:单位/或单位/ml。通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为5万单位, 即:50000gg=005g酪氨酸/lg酶粉。 4.测定意义制革生产中,蛋白酶主要用于酶脱毛,利用酶催化作用,促使生皮毛囊及周围的蛋白质水解而使毛脱落。目前酶法脱毛所用的酶制剂种类也比较多。根据每种酶作用的条件不同, 主要是最适PH不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。而这些酶在出厂后的长途运输及存放过程中,由于条件的变化、振荡、阳光等的作用,其活力要有所改变,故在使用之前必须测定其活力,作为计算酶制剂用量的依据,以达到预期的脱毛效果。即现测现用二、测定原理酶催化 1.酪蛋白酪氨酸条件稳定有关条件,使酶作用底物一定时间,测定底物酪蛋白水能所产生的酪氨酸的量,在相同条件下,所生成酪氨酸的量越多,说明酶催化水解能力越强,活力越大。有关条件:底物浓度C反应温度T反应PH值反应时间t 措施:饱合浓度最适温度最适PH初速度时间内对酶而饱合的浓度恒温水浴缓冲溶液在此区间例:5370.5%酪蛋白 PH=30 10min 27090.5%酪蛋白 40℃ PH=10 10min 13980.5%酪蛋白 PH=7.5 10min 那么水解产物酪氨酸的量如何测定呢?采用分光光度法测定。福林一酚法 2.显色福林试剂+酪氨酸蓝色物质福林试剂在碱性条件下,易被还原性物质还原生成蓝色络合物质(钼蓝、钨蓝的混合物) 而酪氨酸所含的酚羟基具有还原性,可在碱性条件下将福林试剂还原成蓝色物质。蓝色的深浅与酪氨酸的多少成正比。那么蓝色的深浅如何确定呢?通常是通过比色测其消光度来确 HO<○>-CH2-CH-COOH (酪氨酸) NH2 3.朗伯-比尔定律及其应用

Q（反应物的消耗量或生成物的生成量） t↗ to V 恒定 to↗ V ↙ to—反应初速度时间 t to 结论：酶催化反应必须在反应初速度时间内，选择最适温度、最适 PH，饱合底物浓度的条件下才能达到最大反应速度，即此时酶的活力最大。对于测定酶活力时，只有这样才能消除诸多因素的影响，比较各种酶活力的大小。（最大活力、可比性）。 3．什么是酶的活力? 酶催化底物进行反应的本领。酶催化底物反应在一定时间内生成物越多或消耗的反应物量越大，则催化速度越快，活力越高。蛋白酶的活力定义：在一定温度、PH 值条件下，1g 酶粉或 1ml 酶液，每分钟催化水解酪蛋白（或血红蛋白）所产生的酪氨酸的微克数，称为酶的活力。表示为：单位/g 或单位/ml。通常人们爱讲多少个单位。如一般出厂酶活力为 5 万单位，即：50000μg/g =0.05g 酪氨酸/1g 酶粉。 4．测定意义制革生产中，蛋白酶主要用于酶脱毛，利用酶催化作用，促使生皮毛囊及周围的蛋白质水解而使毛脱落。目前酶法脱毛所用的酶制剂种类也比较多。根据每种酶作用的条件不同，主要是最适 PH 不同而分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。其中酸性蛋白酶可用于毛皮的软化。在制革上则主要选用中性和碱性蛋白酶来脱毛。而这些酶在出厂后的长途运输及存放过程中，由于条件的变化、振荡、阳光等的作用，其活力要有所改变，故在使用之前必须测定其活力，作为计算酶制剂用量的依据，以达到预期的脱毛效果。即现测现用。二、测定原理酶催化 1．酪蛋白酪氨酸条件稳定有关条件，使酶作用底物一定时间，测定底物酪蛋白水能所产生的酪氨酸的量，在相同条件下，所生成酪氨酸的量越多，说明酶催化水解能力越强，活力越大。有关条件：底物浓度 C 反应温度 T 反应 PH 值反应时间 t 措施：饱合浓度最适温度最适 PH 初速度时间内对酶而饱合的浓度恒温水浴缓冲溶液在此区间例：537 0.5%酪蛋白 40℃ PH=3.0 10min 2709 0.5%酪蛋白 40℃ PH=10 10min 1398 0.5%酪蛋白 40℃ PH=7.5 10min 那么水解产物酪氨酸的量如何测定呢？采用分光光度法测定。福林—酚法。 2．显色福林试剂 + 酪氨酸 → 蓝色物质福林试剂在碱性条件下，易被还原性物质还原生成蓝色络合物质（钼蓝、钨蓝的混合物）。而酪氨酸所含的酚羟基具有还原性，可在碱性条件下将福林试剂还原成蓝色物质。蓝色的深浅与酪氨酸的多少成正比。那么蓝色的深浅如何确定呢？通常是通过比色测其消光度来确定。 HO— —CH2—CH—COOH ∣ （酪氨酸） NH2 3．朗伯-比尔定律及其应用

有色真溶液入射光强度I 秀过光强度I 当一束单色光(波长一定)通过有色溶液时,溶液的质点要吸收一部分光能,光强减弱。若有色溶液的浓度C不变,液层厚度L越厚,由于增加了溶液的质点,对光的吸收愈多, 即光的强度减弱越多。若L不变,C增大,同样光被吸收的也愈多。且通过实践证明,有色溶液对光的吸收程度,也叫消光度与溶液的浓度C及液层厚度L的乘积成正比。这就是光的吸收定律。即朗伯-比尔定律。公式表示如下 E=K CL=Ig (lo/) E——吸光度、消光值A或光密度OD K一一比例系数或消光系数。其大小与有色溶液的性质。入射光的波长以及溶液的温度有关。测定时,溶液性质一定,选用此溶液最大吸收波长,固定溶液的温度,则K为一个常数,且一般都选用同样厚度的比色皿,即液层厚度在整个测定中保持不变。则K*L也为个常数。则: OD=KLC=K C 这就是说对于一种有色溶液的测定,选用最大吸收波长,固定比色皿厚度,在一定温度下,光密度OD与有色溶液的浓度成直线关系。结合前面所讲的,蓝色的深浅,与蓝色物质的浓度成正比,与酪氨酸的多少成正比,而消光度又与有色溶液的浓度成正比,所以被测组分的浓度(在此为酪氨酸的浓度)与消光度OD成直线关系 OD=KC组分 [RⅪ] P OD 53: OD=KCL=Ig (lo/1)=-Ig(lo/)=-lgT 其中T=o叫透光度或透光率一般分光光度计读盘上常有OD光密度和T透光度两种读数OD=-lgI。而测定时般都用消光度,然后计算其浓度。因为消光度与有色溶液的浓度成正比,是直线关系,而透光度T的负对数才与溶液的浓度C成正比注意:为了保证测定准确性必须 ①选择λmax 有色溶液对于不同波长的光选择吸收。必须在有色溶液的最大波长吸收处。只有在最大波长处,浓度较小的改变,可引起OD较大的改变,灵敏度高。不同的有色溶液最大波长不同,如测定酶活力,钼蓝、钨蓝的最大吸收波长为680nm,我们在此波长下测定。 ②OD值的范围 oD值通常落在0.2~0.6范围,因OD=0.43时测定误差最小,(可计算出)可通过试样称量,改变溶液浓度,或选择不同厚度的比色皿来调节O值的范围。即然OD=KC分,只要知道K,即OD与被测组分浓度的对应关系(直线斜率),要测某组分先测OD值,即可计算出组分含量。那么OD与组分浓度的对应关系如何确定呢?即如何确定K,即如何制作这条直线。 4.制作标准曲线比色分析中,应用朗伯一比尔定律进行测定,首先配制一个已知系列浓度的标准溶液分别显色测其光密度0D值。得到系列对应的光密度值。然后以OD为纵坐标,浓度为横坐标作图,得到一条过原点的直线,称为标准曲线,它反应了0D与组分含量的对应关系。然后测定未知有色溶液的ωD,在标准曲线上找出与被测溶液浓度相对应的C值。通过计算可求出被测溶液组分的含量。如: 要测水解产生的酪氨酸的量,首先用酪氨酸配成不同浓度的标准溶液。显色测OD值.然

当一束单色光（波长一定）通过有色溶液时，溶液的质点要吸收一部分光能，光强减弱。若有色溶液的浓度 C 不变，液层厚度 L 越厚，由于增加了溶液的质点，对光的吸收愈多，即光的强度减弱越多。若 L 不变，C 增大，同样光被吸收的也愈多。且通过实践证明，有色溶液对光的吸收程度，也叫消光度与溶液的浓度 C 及液层厚度 L 的乘积成正比。这就是光的吸收定律。即朗伯-比尔定律。公式表示如下： E=KＣL=lg（I0/I） E——吸光度、消光值 A 或光密度 OD K——比例系数或消光系数。其大小与有色溶液的性质。入射光的波长以及溶液的温度有关。测定时，溶液性质一定，选用此溶液最大吸收波长，固定溶液的温度，则 K 为一个常数，且一般都选用同样厚度的比色皿，即液层厚度在整个测定中保持不变。则 K*L 也为一个常数。则： OD=KLC=K′C 这就是说对于一种有色溶液的测定，选用最大吸收波长，固定比色皿厚度，在一定温度下，光密度 OD 与有色溶液的浓度成直线关系。结合前面所讲的，蓝色的深浅，与蓝色物质的浓度成正比，与酪氨酸的多少成正比，而消光度又与有色溶液的浓度成正比，所以被测组分的浓度（在此为酪氨酸的浓度）与消光度 OD 成直线关系。 OD=KC 组分 [X] → [RX] → OD [X] OD 另：OD=KCL=lg （Io/I）=－lg（Io/I）= －lgT 其中 T=I/Io 叫透光度或透光率一般分光光度计读盘上常有 OD 光密度和 T 透光度两种读数 OD= －lgT。而测定时一般都用消光度，然后计算其浓度。因为消光度与有色溶液的浓度成正比，是直线关系，而透光度 T 的负对数才与溶液的浓度 C 成正比；注意：为了保证测定准确性必须： ①选择λmax 有色溶液对于不同波长的光选择吸收。必须在有色溶液的最大波长吸收处。只有在最大波长处，浓度较小的改变，可引起 OD 较大的改变，灵敏度高。不同的有色溶液最大波长不同，如测定酶活力，钼蓝、钨蓝的最大吸收波长为 680nm，我们在此波长下测定。 ②OD 值的范围 OD 值通常落在 0.2～0.6 范围，因 OD=0.43 时测定误差最小，(可计算出)可通过试样称量，改变溶液浓度，或选择不同厚度的比色皿来调节 OD 值的范围。即然 OD=KC 组分，只要知道 K，即 OD 与被测组分浓度的对应关系(直线斜率)，要测某组分先测 OD 值，即可计算出组分含量。那么 OD 与组分浓度的对应关系如何确定呢?即如何确定 K，即如何制作这条直线。 4．制作标准曲线在比色分析中，应用朗伯－比尔定律进行测定，首先配制一个已知系列浓度的标准溶液，分别显色测其光密度 OD 值。得到系列对应的光密度值。然后以 OD 为纵坐标，浓度为横坐标作图，得到一条过原点的直线，称为标准曲线，它反应了 OD 与组分含量的对应关系。然后测定未知有色溶液的 OD，在标准曲线上找出与被测溶液浓度相对应的 C 值。通过计算可求出被测溶液组分的含量。如：要测水解产生的酪氨酸的量，首先用酪氨酸配成不同浓度的标准溶液。显色测 OD 值.然

后作被测OD C被测液浓度图或求出直线斜率K,再进行计算综上所述,可以总结福林酚法测定蛋白酶活力的方法要点用分析纯的酪氨酸配成不同浓度的标准溶液,在一定条件下(温度、PH、时间)与福林试剂反应显色,再在分光光度计上测定光密度0D值。绘出标准曲线。然后,称取一定量的酶制剂试样,配成适当浓度的溶液,以过量的酪素为底物在一定温度、PH条件下与上述酶液作用。水解反应进行一定时间后,加入三氯醋酸,终止水解反应,并使未水解的酪素沉淀, 过滤,水解产物就留在滤液中,移取滤液,加入碳酸钠中和过量的三氯醋酸,调节P为碱性,加入福林试剂,显色后在分光光度计上测出光密度ω与标准曲线比较,计算出被测酶制剂的活力。剂本次实验所用试剂较多,对于主要试剂重点掌握其配制方法和作用 1.福林试剂——显色剂一一一种杂多酸两个或两个以上的酸酐组成的酸叫多酸。含有相同酸酐的多酸叫同多酸。如: H20·2CrO3 而多酸中含有不相同的酸酐时称为杂多酸。如磷钼酸H3[P(Mo301o)d、磷钨酸H[P(W3O1o)d 福林试剂就是杂多酸磷钨酸和磷钼酸的混合物,是磷酸作为原酸,PO中的σ完全被作为配位酸根的M3002和WO02所取代,形成了以原酸PQ的成酸原子P为中心原子,其它酸根Mo3O2、W3O。2作为配位体的配位酸磷钼酸、磷钨酸。一种络合物杂多酸的制备只需将相应的组分在酸性条件下混合并给以一定的条件,如加热、煮沸等福林试剂的制备,就是制备杂多酸的过程 Mo02、WO2离子在PH降低到酸性范围,则易形成多酸根离子Mo:01o3、WO12 Na2Mo04·2H2o25g 回流 Li20 50g H20 100ml 10hr+了H2O50m1 混匀+溴水一→15 85%H3PO4 50ml 浓HCL 冷却→黄色→过滤→金黄色滤液入棕色试剂瓶。用时按1:2稀释。可长期保存。杂多酸只有在酸性条件下才是稳定的,在碱性条件下杂多酸中的配位酸根很容易被还原成各自元素的还原产物而呈现不同的颜色。如:福林试剂与酪氨酸成钼蓝和钨蓝。 CH2—CH-COOH所含的酚羟基具有还原性,可在碱性条件下将福林还原性试剂还原。加入Br2将福林试剂中的还原性物质氧化得很干净 2.10%三氯醋酸 CL3 CCOOH水溶液,调节PH,终止酶促反应 3.0.55M碳酸钠溶液。中和过量的三氯醋酸,调PH为碱性利于显色 4.缓冲溶液维持酶催反应的在最适門下进行。测定不同种类的酶,则选用不同体系的缓冲溶液以提供最适PH。如:测定537酸性蛋白酶选用PH=3.0的缓冲溶液柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液PH=3.0

后作图或求出直线斜率 K，再进行计算。综上所述，可以总结福林酚法测定蛋白酶活力的方法要点：用分析纯的酪氨酸配成不同浓度的标准溶液，在一定条件下（温度、PH、时间）与福林试剂反应显色，再在分光光度计上测定光密度 OD 值。绘出标准曲线。然后，称取一定量的酶制剂试样，配成适当浓度的溶液，以过量的酪素为底物在一定温度、PH 条件下与上述酶液作用。水解反应进行一定时间后，加入三氯醋酸，终止水解反应，并使未水解的酪素沉淀，过滤，水解产物就留在滤液中，移取滤液，加入碳酸钠中和过量的三氯醋酸，调节 PH 为碱性，加入福林试剂，显色后在分光光度计上测出光密度 OD 与标准曲线比较，计算出被测酶制剂的活力。三、试剂本次实验所用试剂较多，对于主要试剂重点掌握其配制方法和作用。 1．福林试剂——显色剂——一种杂多酸两个或两个以上的酸酐组成的酸叫多酸。含有相同酸酐的多酸叫同多酸。如： H2Cr2O7 → H2O·2CrO3 而多酸中含有不相同的酸酐时称为杂多酸。如：磷钼酸 H3[P（Mo3O10）4]、磷钨酸 H3[P（W3O10）4] 福林试剂就是杂多酸磷钨酸和磷钼酸的混合物，是磷酸作为原酸，PO4 3-中的 O 2-完全被作为配位酸根的 Mo3O10 2- 和 W3O10 2-所取代，形成了以原酸 PO4 3-的成酸原子 P 为中心原子，其它酸根 Mo3O10 2-、 W3O10 2-作为配位体的配位酸磷钼酸、磷钨酸。一种络合物。杂多酸的制备只需将相应的组分在酸性条件下混合并给以一定的条件，如加热、煮沸等。福林试剂的制备，就是制备杂多酸的过程。 MoO4 2- 、WO4 2-离子在 PH 降低到酸性范围，则易形成多酸根离子 Mo3O10 2-、 W3O10 2-。 Na2Wo4·2H2O 100g Na2MoO4·2H2o 25g 回流 Li2O4 50g H2O 100ml ———→10hr + H2O 50ml → 混匀 + 溴水—→15` 85﹪H3PO4 50ml Δ Δ 浓 HCL 100ml →冷却→黄色→ 过滤→金黄色滤液入棕色试剂瓶。用时按 1∶2 稀释。可长期保存。杂多酸只有在酸性条件下才是稳定的，在碱性条件下杂多酸中的配位酸根很容易被还原成各自元素的还原产物而呈现不同的颜色。如：福林试剂与酪氨酸成钼蓝和钨蓝。 HO— —CH2—CH—COOH 所含的酚羟基具有还原性，可在碱性条件下将福林 ∣ 还原性 NH2 试剂还原。加入 Br2 将福林试剂中的还原性物质氧化得很干净。 2．10﹪三氯醋酸 CL3CCOOH 水溶液，调节 PH，终止酶促反应； 3．0.55M 碳酸钠溶液。中和过量的三氯醋酸，调 PH 为碱性利于显色； 4．缓冲溶液维持酶催反应的在最适 PH 下进行。测定不同种类的酶，则选用不同体系的缓冲溶液。以提供最适 PH。如：测定 537 酸性蛋白酶选用 PH=3.0 的缓冲溶液柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液 PH=3.0