生物工程设备课程实验指导 前言 生物化工专业《综合性大型实验》是针对本专业四年级学生开设的一门独立设课的必修 实验课,是专业实践性教学中重要一环。 有以往各课程实验基础上,大型实验课将使学生获得科学实验的强化训练。受到多方面 更加深入、较为完整的运用所学知识,进行实践和提高动手能力的综合性锻炼。使学生不仅 有较扎实的理论知识,又有较强的分析问题和解决问题的实践能力,以适应国家对培养社会 主义现代化建设人才的需要 大型实验课在内容上,把生物化学、微生物学、生物化工的专业理论与实践有机地、紧 密地结合起来,成为对高年级学生进行较为全面、系统的综合训练的实验课 要求参加实验的学生,在教师的正确指导下,经过预习准备,按实验要求,自己独立拟 订实验实施方案,运用实验室条件进行操作,并写出具有一定水平的实验报告,使学生获得 一次类似做科研论文的训练 大型实验课侧重于提高学生的实践能力,引导学生把所学知识和实验内容紧密地结合起 来.并用理论指导实践,解决实验中的问题 学生实验成绩评定,由实验操作技能、实验态度、实验报告与实验中分析问题和解决问 题诸方面综合考核确定。其中实验态度与实验操作能力占50%,实验报告质量与回答问题水 平占50% 第一部分高核糖核酸含量酵母的筛选及发酵试验 (一)高核糖核酸含量的酵母的筛选 简介 核糖核酸是医药工业和食品工业调味剂的重要原科,关于微生物菌体内RNA的含量。 般细菌为0.3~5.1%,酵母为2.7~11%,霉菌为0.7~2.8%。工业上生产核糖核酸主要 由酵母提取制备。核糖核酸得率取决于酵母中核糖核酸的含量,因此提高酵母核糖核酸含量
生物工程设备课程实验指导 前言 生物化工专业《综合性大型实验》是针对本专业四年级学生开设的一门独立设课的必修 实验课，是专业实践性教学中重要一环。 有以往各课程实验基础上，大型实验课将使学生获得科学实验的强化训练。受到多方面 更加深入、较为完整的运用所学知识，进行实践和提高动手能力的综合性锻炼。使学生不仅 有较扎实的理论知识，又有较强的分析问题和解决问题的实践能力，以适应国家对培养社会 主义现代化建设人才的需要。 大型实验课在内容上，把生物化学、微生物学、生物化工的专业理论与实践有机地、紧 密地结合起来，成为对高年级学生进行较为全面、系统的综合训练的实验课。 要求参加实验的学生，在教师的正确指导下，经过预习准备，按实验要求，自己独立拟 订实验实施方案，运用实验室条件进行操作，并写出具有一定水平的实验报告，使学生获得 一次类似做科研论文的训练。 大型实验课侧重于提高学生的实践能力，引导学生把所学知识和实验内容紧密地结合起 来．并用理论指导实践，解决实验中的问题。 学生实验成绩评定，由实验操作技能、实验态度、实验报告与实验中分析问题和解决问 题诸方面综合考核确定。其中实验态度与实验操作能力占50％，实验报告质量与回答问题水 平占50％。 第－部分 高核糖核酸含量酵母的筛选及发酵试验 （一）高核糖核酸含量的酵母的筛选 简介 核糖核酸是医药工业和食品工业调味剂的重要原科，关于微生物菌体内ＲＮＡ的含量。 －般细菌为0.3～5.1％，酵母为2.7～11％，霉菌为0.7～2.8％。工业上生产核糖核酸主要 由酵母提取制备。核糖核酸得率取决于酵母中核糖核酸的含量，因此提高酵母核糖核酸含量
是工业生产核糖核酸的关键。 菌种的活化及扩大培养 (一)菌种与材料: l.菌种:丹麦啤酒酵母菌、产朊假丝酵母菌等 2.培养基:麦芽汁培养基 麦芽琼脂培养基 3.器材:水浴锅、烧杯、比色盘、碘液、纱布、灭菌锅、漏斗、试管等。 (二)方珐与步骤: 1.流程:液体石蜡保藏菌种 麦芽汁培养基活化(三天) 麦芽琼脂固体培养基(一天) 2.步骤 (Ⅰ)麦芽汁的制备:干麦芽首先进行压碎。加3~4倍水,浸泡1小时,然后升温至63℃糖 化4~6小时,用1/50N碘液测定为黄色至无色。用纱布过滤,可以反夏回流,直到滤液透 明澄清为止,即为麦芽汁。分装后1公斤/厘米蒸汽灭菌15分钟备用。 2)固体斜面麦芽培养基的制备:用12巴林的麦芽汁加2%琼脂加热使溶解,然后分装于 试管中(约装四分之一),放在灭菌釜中用1公斤/厘米,121℃灭菌15分钟。灭菌后倾 斜摆斜面,然后放在30℃恒温箱中使培养基上蒸汽水逐渐干燥,再置冰箱中保存待用。 要求 (1)麦芽汁浓度应为11~12巴林,pH5以上,制成的麦芽汁应为淡黄色透明,无其它悬浮 2)斜面培养基需待表面蒸汽水干燥后,才能接种 (3)制备培养基所用水份,应用自来水较好 、摇瓶发酵条件试验 摇瓶培养的目的有二:一是寻求发酵培养基的合适配方,二是寻找最佳发酵条件。微生 物发酵法是一个受多种因素影响的工艺过程,应用一般的简单比较法很难得到满意的结果, 实验室中往往采用正交设计方法,对所研究的菌种进行试验 正交试验法是一种安排和分析试验的方法,这种方法可以通过较少的试验次数和比较简便的
是工业生产核糖核酸的关键。 一、菌种的活化及扩大培养 （一）菌种与材料： ｌ．菌种：丹麦啤酒酵母菌、产朊假丝酵母菌等 ２．培养基：麦芽汁培养基 麦芽琼脂培养基 ３．器材：水浴锅、烧杯、比色盘、碘液、纱布、灭菌锅、漏斗、试管等。 （二）方珐与步骤： １．流程：液体石蜡保藏菌种 ↓ 麦芽汁培养基活化（三天） ↓ 麦芽琼脂固体培养基（一天） ２．步骤： （ｌ）麦芽汁的制备：干麦芽首先进行压碎。加3～4倍水，浸泡1小时，然后升温至63℃糖 化4～6小时，用1／50Ｎ碘液测定为黄色至无色。用纱布过滤，可以反夏回流，直到滤液透 明澄清为止，即为麦芽汁。分装后1公斤／厘米2蒸汽灭菌15分钟备用。 （２）固体斜面麦芽培养基的制备：用12巴林的麦芽汁加2％琼脂加热使溶解，然后分装于 试管中（约装四分之一），放在灭菌釜中用1公斤／厘米2，121℃灭菌１５分钟。灭菌后倾 斜摆斜面，然后放在30℃恒温箱中使培养基上蒸汽水逐渐干燥，再置冰箱中保存待用。 ３．要求： （ｌ）麦芽汁浓度应为11～12巴林，pＨ5以上，制成的麦芽汁应为淡黄色透明，无其它悬浮 物质。 （２）斜面培养基需待表面蒸汽水干燥后，才能接种。 （３）制备培养基所用水份，应用自来水较好。 二、摇瓶发酵条件试验 摇瓶培养的目的有二：一是寻求发酵培养基的合适配方，二是寻找最佳发酵条件。微生 物发酵法是一个受多种因素影响的工艺过程，应用一般的简单比较法很难得到满意的结果， 实验室中往往采用正交设计方法，对所研究的菌种进行试验。 正交试验法是一种安排和分析试验的方法，这种方法可以通过较少的试验次数和比较简便的
分析方法,获得较好的结果,它的特点是挑选一部分有代表性的试验项目,利用正交表来进 行整体设计。可以同时做一批试验,减少试验次数,缩短试验周期。通过分析,它能告诉我 们,哪些因索是显著因素,哪些是非显著因素,以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大 小,还能分析出试验误差的大小。 正交试验包括两部分内容,设计试验方案和分析试验结果。 (一)菌种与材料: 1.茵种:同(一) 2.摇瓶发酵培养基:葡萄糖、硫酸铵、 KH2 POA0.3%、ZnSO0.1%、FeSO0.05%(pH5. 温度30℃) 3.材料:按正交表配制培养基,确定发酵条件。 (二)方法与步骤: 1.明确试验目的,确定试验因素,影响发酵的因素很多,考虑到实验室条件及人力和时间, 我们不能在一次试验中包括所有因素,本实验主要从葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四 个因素,每因素选择三个水平,采用正交表L。(34) 2.列出水平表,根据生产上发酵的现有了解,把葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四个 因素各分成三个水平 3.选择正交表:根据人力、物力、试验任务,确定因素水平后,选出正交表。表头中L表 示正交表,L右下脚9表示有9行,可用来安排9个试验。括号内底数3是因素水平数,指 数4是4个因素。 4.根据因素水平表(表头设计),把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字 5.试验结果分析 从正交试验结果中,我们可以得到本次实验的直观最佳条件,但这不一定是最佳理论值。我 们可以根据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较,在下一步试验中可以在这些水平范围 内,进行改变和加密水平以求得更佳条件。表中R为极差,极差大小反应了因素变化时试验 指标变化的幅度,因素的极差越大,该因素对指标的影响也会越大,也就越重要,就更需要 控制在最佳水平上。 6.验证正交试验结果。 (三)操作: 斜面菌种培养物一环分别接入摇瓶发酵培养基,30℃,300转/分钟摇瓶机上振荡培养 22~26小时,按正交表定时取出
分析方法，获得较好的结果，它的特点是挑选一部分有代表性的试验项目，利用正交表来进 行整体设计。可以同时做一批试验，减少试验次数，缩短试验周期。通过分析，它能告诉我 们，哪些因索是显著因素，哪些是非显著因素，以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大 小，还能分析出试验误差的大小。 正交试验包括两部分内容，设计试验方案和分析试验结果。 （一）菌种与材料： ｌ．茵种：同（一） ２．摇瓶发酵培养基：葡萄糖、硫酸铵、KH2PO4 0.3％、ZnSO4 0.1％、FeSO4 0.05％（pH 5.1, 温度30℃） ３．材料：按正交表配制培养基，确定发酵条件。 （二）方法与步骤： １．明确试验目的，确定试验因素，影响发酵的因素很多，考虑到实验室条件及人力和时间， 我们不能在一次试验中包括所有因素，本实验主要从葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四 个因素，每因素选择三个水平，采用正交表Ｌ9（3 4）。 ２．列出水平表，根据生产上发酵的现有了解，把葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四个 因素各分成三个水平。 ３.选择正交表：根据人力、物力、试验任务，确定因素水平后，选出正交表。表头中 L 表 示正交表，L 右下脚 9 表示有 9 行，可用来安排 9 个试验。括号内底数 3 是因素水平数，指 数 4 是 4 个因素。 ４.根据因素水平表（表头设计），把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字。 ５．试验结果分析 从正交试验结果中，我们可以得到本次实验的直观最佳条件，但这不一定是最佳理论值。我 们可以根据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较，在下一步试验中可以在这些水平范围 内，进行改变和加密水平以求得更佳条件。表中R为极差，极差大小反应了因素变化时试验 指标变化的幅度，因素的极差越大，该因素对指标的影响也会越大，也就越重要，就更需要 控制在最佳水平上。 ６．验证正交试验结果。 （三）操作： 斜面菌种培养物－环分别接入摇瓶发酵培养基，30℃，300转／分钟摇瓶机上振荡培养 22～26小时，按正交表定时取出
培养期间要注意培养温度、环境清活和摇瓶机工作状态。 发酵完毕测定酵母及其核酸含量,填人表中进行计算和讨论 三、酵母生物量测量和核酸含量测定 利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的计数法.此法的优点是直观、快速 将经过适当稀释的菌悬液注人血球计数板的计数室中,然后在显微镜下进行计数。 实验器材及具体步骤,参看《微生物学实验》实验三十的有关内容 (二)用于核酸生产的酵母培养10升发酵罐试验 、实验主要内容和要求 (一)本次实验的方案由同学们自己制定,实验应包括下列内容 1.用第一阶段在微生物实验中优选出的菌种,进行液体摇瓶种子扩大培养,供发酵接种用 种量自定。为保证发酵有较好的种子,可培养2~3倍种量的种子,择优接种 2.进行发酵。包括配制发酵培养基,补料准备,空消和实消,发酵过程的分析控制和适时 分批补料。 并要求发酵过程每一小时至少分析一次,分析项目为pH,醇母数、总糖、还原糖、核酸含 量和菌体镜检,并记录结果 发酵过程中应根据发酵状况及时调节控制合适的风量、罐压、罐温和搅拧转速,适时补料, 并且每半小时至少记录一次这些参数值。 3.判定发酵终点,在发酵结束后冰箱保存,以备实验用。 4.测定灭菌前后及工作过程的空气含菌量 5.测定并记录发酵液的溶氧浓度变化 (二)第二阶段实验内容多,综合性强,并且需要同学们独立制定实验的全盘方案和组织实 验,故本次实验有以下几个要求 1.充分做好实验前的预习 在实验前,要求同学们对实验的内容,所涉及的有关理论知识和曾做过的有关实验操作都要 充分预习和复习,做到心中有数。 2.独立制定实验全盘方案 在充分预习的基础上,以实验小组为单位,独立制定实验的全盘实施方案。并在实验前提交 指导教师审阅后,按方案进行实验
培养期间要注意培养温度、环境清活和摇瓶机工作状态。 发酵完毕测定酵母及其核酸含量，填人表中进行计算和讨论。 三、酵母生物量测量和核酸含量测定 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的计数法．此法的优点是直观、快速。 将经过适当稀释的菌悬液注人血球计数板的计数室中，然后在显微镜下进行计数。 实验器材及具体步骤，参看《微生物学实验》实验三十的有关内容。 （二）用于核酸生产的酵母培养１０升发酵罐试验 －、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验应包括下列内容： １．用第一阶段在微生物实验中优选出的菌种，进行液体摇瓶种子扩大培养，供发酵接种用， 种量自定。为保证发酵有较好的种子，可培养２～３倍种量的种子，择优接种。 ２．进行发酵。包括配制发酵培养基，补料准备，空消和实消，发酵过程的分析控制和适时 分批补料。 并要求发酵过程每一小时至少分析一次，分析项目为ｐＨ，醇母数、总糖、还原糖、核酸含 量和菌体镜检，并记录结果。 发酵过程中应根据发酵状况及时调节控制合适的风量、罐压、罐温和搅拧转速，适时补料， 并且每半小时至少记录一次这些参数值。 ３．判定发酵终点，在发酵结束后冰箱保存，以备实验用。 ４．测定灭菌前后及工作过程的空气含菌量。 ５．测定并记录发酵液的溶氧浓度变化。 （二）第二阶段实验内容多，综合性强，并且需要同学们独立制定实验的全盘方案和组织实 验，故本次实验有以下几个要求: １．充分做好实验前的预习 在实验前，要求同学们对实验的内容，所涉及的有关理论知识和曾做过的有关实验操作都要 充分预习和复习，做到心中有数。 ２．独立制定实验全盘方案 在充分预习的基础上，以实验小组为单位，独立制定实验的全盘实施方案。并在实验前提交 指导教师审阅后，按方案进行实验
方案内容大致包括 (1)种子培养基配方、配制量和每个摇瓶的装量,灭菌温度和时间,培养温度和时同。 2)发酵培养基配方和配制量,发酵罐空消、实消温度和时间,发酵过程中温度、通气比 和搅拌转速 (3)补料配方和配制量,灭菌温度和时间,计划补料时间,每次补料量。 (4)发酵终点判定方法。 (5)实验所需的各种器具、试剂 3.认真完成实验准备工作 本实验分菌种培养、发酵二个阶段,并且发酵过程中又有补料、分析和控制,因此操作步骤 和次数均较多。要求每次操作前都要做好准备工作,特别是无菌器具要提前灭菌以备使用 4.认真做好发酵过程的观察分析控制和交接班工作 发酵过程时间较长,操作内容多,故在发酵过程中应认真观察发酵过程中的各种参数,及时 取样分析,根据发酵状况给予调节控制并适时补料.努力把发酵控制在最佳状态。 由于发酵时间长,在发酵过程中同学们将分组轮换值班.故在交接班时,要做好交接工 作, 、各种发酵因素对酵母的影响 下面将各种发酵的影响因素提供给大家在制定方案和发酵控制时参考。 1.发酵温度。各种微生物都有自己最适宜的生长温度,酵母最适宜的生长温度是30℃。如 果发酵温度太高,在发酵时易产生沉淀现象。如果发酵温度太低,酵母发酵生长缓慢,产量 下降 2.发酵pH。发酵液中的pH对酵母发育有很大的影响,因为pH影响到酵母的生理机能, 在酸性培养基中,水份及其中的营养成分,容易渗透到细胞原生质内 3.化学因子的影响。不同的微生物对某些化学因子的稳定性表现不同。各种酵母的RNA 含量因培养条件而定,若提高铵离子、磷酸离子的浓度,RNA的含量就会增加。培养基的 c/h比率低时,RNA的含量较高。在培养基中添加由Fe2、Zu2、Cu2组成的混合 液,对RNA的含量具有明显的促进效果 4.通气量。酵母属兼氧性微生物,在供氧和缺氧的条件下,酵母细胞的生命活动和能量转 换是不同的。在有氧条件下,酵母进行有氧呼吸,糖被分解为水和CO2。在无氧条件下 酵母对糖进行发酵,糖被发酵乙醇和CO2。因此醇母培养需要有适当的含氧量
方案内容大致包括： （１）种子培养基配方、配制量和每个摇瓶的装量，灭菌温度和时间，培养温度和时同。 （２）发酵培养基配方和配制量，发酵罐空消、实消温度和时间，发酵过程中温度、通气比 和搅拌转速。 （３）补料配方和配制量，灭菌温度和时间，计划补料时间，每次补料量。 （４）发酵终点判定方法。 （５）实验所需的各种器具、试剂。 ３．认真完成实验准备工作 本实验分菌种培养、发酵二个阶段，并且发酵过程中又有补料、分析和控制，因此操作步骤 和次数均较多。要求每次操作前都要做好准备工作，特别是无菌器具要提前灭菌以备使用。 ４．认真做好发酵过程的观察分析控制和交接班工作 发酵过程时间较长，操作内容多，故在发酵过程中应认真观察发酵过程中的各种参数，及时 取样分析，根据发酵状况给予调节控制并适时补料．努力把发酵控制在最佳状态。 由于发酵时间长，在发酵过程中同学们将分组轮换值班．故在交接班时，要做好交接工 作。 二、各种发酵因素对酵母的影响 下面将各种发酵的影响因素提供给大家在制定方案和发酵控制时参考。 １．发酵温度。各种微生物都有自己最适宜的生长温度，酵母最适宜的生长温度是30℃。如 果发酵温度太高，在发酵时易产生沉淀现象。如果发酵温度太低，酵母发酵生长缓慢，产量 下降。 ２．发酵ｐＨ。发酵液中的ｐＨ对酵母发育有很大的影响，因为ｐＨ影响到酵母的生理机能， 在酸性培养基中，水份及其中的营养成分，容易渗透到细胞原生质内。 ３．化学因子的影响。不同的微生物对某些化学因子的稳定性表现不同。各种酵母的ＲＮＡ 含量因培养条件而定，若提高铵离子、磷酸离子的浓度，ＲＮＡ的含量就会增加。培养基的 ｃ／ｈ比率低时，ＲＮＡ的含量较高。在培养基中添加由Ｆｅ2+、Ｚｕ2+、Ｃｕ2+组成的混合 液，对ＲＮＡ的含量具有明显的促进效果。 ４．通气量。酵母属兼氧性微生物，在供氧和缺氧的条件下，酵母细胞的生命活动和能量转 换是不同的。在有氧条件下，酵母进行有氧呼吸，糖被分解为水和ＣＯ2。在无氧条件下， 酵母对糖进行发酵，糖被发酵乙醇和ＣＯ2。因此醇母培养需要有适当的含氧量