第十四章RNA的生物合成 RNA的生物合成包括转录和RNA的复制。 转录( transcription):以段DNA的遗传信息为模板,在RNA聚合酶作用下,合成出对应的RNA的过 程,或在DNA指导下合成RNA 转录产物:mRNA、rRNA、tRNA、小RNA 除某些病毒基因组RNA外,绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物 转录研究的主要问题 ①RNA聚合酶②转录过程③转录后加工④转录的调控 ①③是基本内容,④是目前研究的焦点,转录调控是基因调控的核心。 转录与DNA复制的异同: 相同:要有模板,新链延伸方向5ˆ→3,碱基的加入严格遵循碱基配对原则 相异:①复制需要引物,转录不需引物。 ②转录时,模板DNA的信息全保留,复制时模板信息是半保留。 ③转录时,RNA聚合酶只有5→3聚合作用,无5→3及3→5外切活性。 转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步, 基因表达的终产物:①RNA②蛋白质 转录过程涉及两个方面 ①RNA合成的酶学过程 ②RNA合成的起始信号和终止信号,即DNA分子上的特定序列 DNA正链:与mRNA序列相同的DNA链。 负链:与正链互补的DNA链 转录单位的起点核苷酸为+1,起点右边为下游(转录区),转录起点左侧为上游,用负数表示:-1,2, 第一节DNA指导的RNA合成(转录) RNA链的转录,起始于DNA模板的一个特定位点,并在另一位点终止,此转录区域称为一个转录单位 一个转录单位可以是一个基因(真核),也可以是多个基因(原核)。 基因的转录是有选择性的,细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变,将转录不同的基因 转录的起始由DNA上的启动子区控制,转录的终止由DNA上的终止子控制,转录是通过DNA指导的 RNA聚合酶来实现的。 RNA聚合酶 RNA合成的基本特征 ①底物:NTP(ATP、GIP、CIP、UTP) ②RNA链生长方向:5
１ 第十四章 RNA 的生物合成 RNA 的生物合成包括转录和 RNA 的复制。 转录（transcription）：以一段DNA的遗传信息为模板，在 RNA 聚合酶作用下，合成出对应的RNA的过 程，或在 DNA 指导下合成 RNA。 转录产物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA 除某些病毒基因组RNA 外，绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。 转录研究的主要问题 ①RNA 聚合酶 ②转录过程 ③转录后加工 ④转录的调控 ①~③是基本内容，④是目前研究的焦点，转录调控是基因调控的核心。 转录与 DNA复制的异同： 相同：要有模板，新链延伸方向5’→3’，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。 相异：①复制需要引物，转录不需引物。 ②转录时，模板DNA的信息全保留，复制时模板信息是半保留。 ③转录时，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，无 5’→3’及 3’→5’外切活性。 转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。 基因表达的终产物：①RNA ②蛋白质 转录过程涉及两个方面 ①RNA 合成的酶学过程 ②RNA 合成的起始信号和终止信号，即DNA分子上的特定序列。 DNA 正链：与 mRNA序列相同的DNA链。 负链：与正链互补的DNA链。 转录单位的起点核苷酸为+1，起点右边为下游（转录区），转录起点左侧为上游，用负数表示：-1，-2， -3。 第一节 DNA 指导的 RNA 合成（转录） RNA 链的转录，起始于 DNA 模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。 一个转录单位可以是一个基因（真核），也可以是多个基因（原核）。 基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。 转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由 DNA上的终止子控制，转录是通过 DNA 指导的 RNA 聚合酶来实现的。 一、 RNA 聚合酶 RNA 合成的基本特征 ①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP） ②RNA 链生长方向：5’→3’
③不需引物 ④需DNA模板 反应 n,ATP+nGTP+nCTP+nUPN4聚合酶/DN4模板、“→RNA+(1+n2+n3+n)PP l、E, colirna聚合酶(原核) Ecol和其它原核细胞一样,只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA(mRNA、tRNA、rRNA) 个Ecol细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,在任时刻,大部分聚合酶(5000左右)正在参与 RNA的合成,具体数量依生长条件而定 E colirNA聚合酶全酶( holoenzyme)分子量4万Da,由六个亚基组成,a2BB0o,另有两个Zn2。 无σ亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,加入σ亚 基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,σ亚基称为起始因子。 E. COlI RNA聚合酶各亚基的大小与功能 亚基 亚基数分子量基因 功能 (KD) 160 与模板DNA结合 Bβ0a 150 B 与核苷酸结合,起始和催化部位。 70 D 起始识别因子 37 rpoA 与DNA上启动子结合 不详 不同的细菌,B、β、a亚基分子量变化不大,σ亚基分子量变化较大,44KD9KD。 σ亚基的功能:核心酶在DNA上滑动,σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数,增加停留时间,使 聚合酶迅速找到启动子并与之结合,σ亚基本身无催化活性 不同的因子识别不同的启动子,从而表达不同的基因。 不同的原核生物,都具有相同的核心酶,但σ亚基有所差别,这决定了原核基因表达的选择性。 RNA聚合酶的催化活性:RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开, 转录后DNA仍然保持双链的结构。 P360图20-1RNA聚合酶的活性中心 核心酶覆盖60bp的DNA区域,其中解链部分17bp左右, RNA-DNA杂合链约12b 纯的RNA聚合酶,在离体条件下可转录双链DNA,但在体内,DNA的两条链中只有一条可用于转录, 这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的
２ ③不需引物 ④需 DNA 模板 反应： 1、 E.coli RNA聚合酶（原核） E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。 一个 E.coli 细胞中约有 7000 个 RNA 聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000 左右）正在参与 RNA 的合成，具体数量依生长条件而定。 E.coliRNA 聚合酶全酶（| holoenzyme）分子量 46万 Da，由六个亚基组成，α2ββ’ σω，另有两个 Zn2+。 无σ亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的 RNA 链延长，而不具备起始合成活性，加入σ亚 基后，全酶才具有起始合成RNA 的能力，因此，σ亚基称为起始因子。 E.coli RNA 聚合酶各亚基的大小与功能： 亚基 亚基数 分 子 量 （KD） 基因 功能 β’ 1 160 rpoC 与模板 DNA结合 β 1 150 rpoB 与核苷酸结合，起始和催化部位。 σ 1 70 rpoD 起始识别因子 α 2 37 rpoA 与 DNA上启动子结合 ω 1 9 ---- 不详 不同的细菌，β’、β、α亚基分子量变化不大，σ亚基分子量变化较大，44KD~92KD。 σ亚基的功能：核心酶在 DNA 上滑动，σ亚基能增加酶与 DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使 聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性。 不同的σ因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。 不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。 RNA 聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开， 转录后 DNA仍然保持双链的结构。 P360 图 20-1RNA 聚合酶的活性中心 核心酶覆盖60bp 的DNA 区域，其中解链部分17bp 左右，RNA-DNA 杂合链约12bp。 纯的RNA聚合酶，在离体条件下可转录双链 DNA，但在体内，DNA的两条链中只有一条可用于转录， 这可能是由于 RNA 聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的。 RNA n n n n PPi RNA DNA Mg n ATP n GTP n CTP n UTP ( 1 2 3 4) / 2 1 + 2 + 3 + 4 ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ ⎯→ + + + + 聚合酶 模板、 +
解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性,在酶的前端解螺旋,在后端以相反方冋重新螺旋化, 活体状况中,可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。 37℃时,RNA聚合酶的聚合速度可达40-100个核苷酸秒 2、真核生物RNA聚合酶 真核生物的转录机制要复杂得多,有三种细胞核内的RNA聚合酶:RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚 合酶Ⅱ转录mRNA,RNA聚合酶Ⅱ转录tRNA和其它小分子RNA。这三种RNA聚合酶分子量都在50万 左右,亚基数分别为6-15。 P362表203真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能 动物、植物、昆虫等不同来源的细胞, NAPoli的活性都可被低浓度的α鹅膏蕈碱抑制,而 RNApol Ⅰ不受抑制。 动物 RNApoll受高浓度的α鹅膏蕈碱抑制,而酵母、昆虫的 RNApoll不受抑制。 除了细胞核RNA聚合酶外,还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶,它们的结构简单,能转录所有种类 的RNA,类似于细菌RNA聚合酶 3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶 仅为一条分子量IIKD的多肽链,这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其 作用,37℃时的聚合速度20n秒 二、RNA聚合酶催化的转录过程( E coli) P361图202 1、起始 RNA聚合酶结合到DNA双链的特定部位,局部解开双螺旋,第一个核苷酸掺入转录起始位点,从此开 始RNA链的延伸。 在新合成的RNA链的5未端,通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷(pG或ppA),即合成的第 个底物是GIP或ATP 起始过程中,σ因子起关键作用,它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合,σ亚基与β'结合时,β 亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合,。 正链:与mRNA序列相同的两、链。 负链:模板链。 转录起点是+1,上游是-1。 2、延长 转录起始后,σ亚基释放,离开核心酶,使核心酶的β亚基构象变化,与DNA模板亲和力下降,在
３ 解旋和重新螺旋化也是 RNA 聚合酶的内在特性，在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化， 活体状况中，可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。 37℃时，RNA聚合酶的聚合速度可达40~100 个核苷酸/秒 2、 真核生物RNA聚合酶 真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA 聚合酶：RNA 聚合酶I 转录 rRNA，RNA 聚 合酶II 转录 mRNA，RNA聚合酶 III 转录tRNA和其它小分子 RNA。这三种 RNA 聚合酶分子量都在 50 万 左右，亚基数分别为6-15。 P362 表 20-3 真核生物RNA聚合酶的分类、分布及各自的功能 动物、植物、昆虫等不同来源的细胞，RNApolⅡ的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而 RNApol Ⅰ不受抑制。 动物 RNApolⅢ受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制，而酵母、昆虫的 RNApolⅢ不受抑制。 除了细胞核 RNA 聚合酶外，还分离到线粒体和叶绿体 RNA聚合酶，它们的结构简单，能转录所有种类 的 RNA，类似于细菌RNA聚合酶。 3、 噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶 仅为一条分子量 11KD 的多肽链，这些聚合酶只需要识别噬菌体 DNA 的少数启动子，并无选择地与其 作用，37℃时的聚合速度200nt/秒。 二、 RNA 聚合酶催化的转录过程（E.coli） P361 图 20-2 1、 起始 RNA 聚合酶结合到DNA双链的特定部位，局部解开双螺旋，第一个核苷酸掺入转录起始位点，从此开 始 RNA链的延伸。 在新合成的 RNA 链的 5’末端，通常为带有三个磷酸基团的鸟苷或腺苷（pppG 或 pppA），即合成的第一 个底物是 GTP 或ATP。 起始过程中，σ因子起关键作用，它能使聚合酶迅速地与DNA的启动子结合，σ亚基与β’结合时，β’ 亚基的构象有利于核心酶与启动子紧密结合，。 正链：与 mRNA序列相同的两、链。 负链：模板链。 转录起点是+1，上游是-1。 2、 延长 转录起始后，σ亚基释放，离开核心酶，使核心酶的β’亚基构象变化，与 DNA 模板亲和力下降，在
DNA上移动速度加快,使RNA链不析延长 转录起始后,σ亚基便从全酶中解离出来,然后nsA亚基结合到核心酶上,由nsA亚基识别序列序列 3、终止 RNA聚合酶到达转录终止点时,在终止辅助因子的帮助下,聚合反应停止,RNA链和聚合酶脱离DNA 模板链,musA又被σ亚基所取代。 由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。 启动子和转录因子 启动子:RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的段DNA序列。 转录因子:RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转 录因 足迹法和DNA测序法确定启动子的序列结构。 原核启动子结构与功能 分析比较上百种启动子序列,发现不同的启动子都存在保守的共同序列,包括RNA聚合酶识别位点和 结合位点。 (1)、-10序列 (Pribnow框 在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列 TATAAT,称 Pribnow框。此段序列出现在4到13bp 之间,每个位点的保守性在459%1009 频度:T9 A89 toa6 5 A65 T100 据预测, Pribnow框中,一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酎时起十分重要的作用。 目前认为, Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物, Pribnow框中DNA 序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶牢固的结合位点,是启动子的关键部位。 RNA聚合酶的结合,诱导富含AT的 Pribnow框的双链解开,然后进步扩大成17个核苷酸长度的泡 状物,在泡状物中RNA聚合酶从模板链开始转录RNA产物。 (2)、-35序列( Sexfama box)(识别区域) 只含10序列的DNA不能转录,在10序列上游还有一个保守序列,其中心约在35位置,称为35序列, 此序列为RNA酶的识别区域 各碱基出现频率如下:TsTG8A61C6Aa,其中TTG十分保守。 35序列的功能:它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此,-35序列对RNA聚合酶 全酶有很髙的亲和性。-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的 启动子。 35序列提供RNA聚合酶识别信号, 10序列有助于DNA局部双链解开
４ DNA 上移动速度加快，使RNA链不断延长。 转录起始后，σ亚基便从全酶中解离出来，然后 nusA亚基结合到核心酶上，由 nusA 亚基识别序列序列。 3、 终止 RNA 聚合酶到达转录终止点时，在终止辅助因子的帮助下，聚合反应停止，RNA 链和聚合酶脱离 DNA 模板链，nusA 又被σ亚基所取代。。 由此形成 RNA 聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。 三、 启动子和转录因子 启动子：RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA 序列。 转录因子：RNA 聚合酶在进行转录时，常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，此类蛋白质统称为转 录因子。 足迹法和 DNA 测序法确定启动子的序列结构。 P363 （一） 原核启动子结构与功能 分析比较上百种启动子序列，发现不同的启动子都存在保守的共同序列，包括 RNA 聚合酶识别位点和 结合位点。 （1）、 -10 序列（Pribnow 框） 在转录起点上游大约-10 处，有一个 6bp 的保守序列 TATAAT，称 Pribnow 框。此段序列出现在-4 到-13bp 之间，每个位点的保守性在45%-100%。 频度： T89 A89T50A65A65 T100 据预测，Pribnow框中，一开始的TA 和第6 位最保守的T在结合RNA 聚合酶时起十分重要的作用。 目前认为，Pribnow 框决定转录方向。酶在此部位与 DNA 结合形成稳定的复合物，Pribnow 框中 DNA 序列在转录方向上解开，形成开放型起始结构，它是RNA 聚合酶牢固的结合位点，是启动子的关键部位。 RNA 聚合酶的结合，诱导富含 AT 的 Pribnow 框的双链解开，然后进一步扩大成 17 个核苷酸长度的泡 状物，在泡状物中RNA 聚合酶从模板链开始转录RNA 产物。 （2）、 -35 序列（Sexfama box）（识别区域） 只含-10 序列的DNA不能转录，在-10 序列上游还有一个保守序列，其中心约在-35 位置，称为-35 序列， 此序列为 RNA 酶的识别区域。 各碱基出现频率如下：T85 T83 G81A61C69A52 ，其中TTG 十分保守。 -35 序列的功能：它是原核 RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。因此，-35 序列对 RNA 聚合酶 全酶有很高的亲和性。-35 序列的核苷酸结构，在很大程度上决定了启动子的强度，RNA聚合酶易识别强的 启动子。 -35 序列提供RNA聚合酶识别信号， -10 序列有助于DNA 局部双链解开
启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 P364图204原核型启动子的结构 (二)真核启动子 真核基因的转录十分复杂,对启动子的分析要比原核基因的困难得多。 真核生物有三种RNA聚合酶:RNA聚合酶I、IⅢ,分别转录RNA、mRNA、tRNA和小分子RNA 这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。 l、RNA聚合酶Ⅱ的启动子 RNA聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区: (1)、TATA框( Hones框 中心在-25至30,长度bp左右 碱基频率:T8AgA8A63(T37)A83As(T37)(全为A-T,少数含有一个GC对 此序列功能:使DNA双链解开,并决定转录的起点位置,失去TAIA框,转录将可能在许多位点上开 始 TAⅨA框的改变或缺失,直接景响DNA与酶的结合程度,会使转录起始点偏移,因此,TATA是绝大多 数真核基因正确表达所必需的。 由于RNA聚合酶分子有相对固定的空间结构,同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离,决定了 起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构,这两者把酶置于种正确的构象中,决定了识别的 正确性和转录起始的正确性。 (2)、CAT框 中心在75处,9p,共有序列GGT(G) CAATCT 功能:与RNA聚合酶结合。 (3)、GC框 在CAAT框上游,序列 GGGCGG,与某些转录因子结合。 CAAT和GC框均为上游序列,对转录的起始频率有较大景响。 2、 RNApoLⅢ的启动子 RNApoll的启动子在转录区内部。 P365图205由RNA聚合酶Ⅲ转录的三个基因的启动子 四、终止子和终止因子 终止子:提供转录终止信号的段DNA序列。 终止因子:协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。 有些终止子的作用可被特异的因子所阻止,使酶越过终止子继续转录,称为通读,这类引起抗终止作用
５ 启动子结构的不对称性决定了转录的方向。 P364 图 20-4 原核型启动子的结构 （二） 真核启动子 真核基因的转录十分复杂，对启动子的分析要比原核基因的困难得多。 真核生物有三种 RNA 聚合酶：RNA聚合酶I、II、III，分别转录 rRNA、mRNA、tRNA 和小分子 RNA， 这三类聚合酶的启动子各有其结构特点。 1、 RNA 聚合酶Ⅱ的启动子 RNA 聚合酶Ⅱ的启动子有三个保守区： （1）、 TATA 框（Hogness 框） 中心在-25 至-30，长度7bp 左右。 碱基频率：T82A97A85A63 （T37 ）A83A50（T37 ）（全为A-T，少数含有一个G-C 对）。 此序列功能：使 DNA 双链解开，并决定转录的起点位置，失去 TATA 框，转录将可能在许多位点上开 始。 TATA 框的改变或缺失，直接影响 DNA与酶的结合程度，会使转录起始点偏移，因此，TATA 是绝大多 数真核基因正确表达所必需的。 由于 RNA 聚合酶分子有相对固定的空间结构，同此框的结合位点和转录反应催化位点的距离，决定了 起始位点的正确选择。启动子特定序列和酶的正确结构，这两者把酶置于一种正确的构象中，决定了识别的 正确性和转录起始的正确性。 （2）、 CAAT 框 中心在-75 处，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT 功能：与 RNA 聚合酶结合。 （3）、 GC 框 在 CAAT框上游，序列GGGCGG，与某些转录因子结合。 CAAT和GC 框均为上游序列，对转录的起始频率有较大影响。 2、 RNApolⅢ的启动子 RNApolⅢ的启动子在转录区内部。 P365 图 20-5 由 RNA 聚合酶III 转录的三个基因的启动子 四、 终止子和终止因子 终止子：提供转录终止信号的一段DNA 序列。 终止因子：协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。 有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使酶越过终止子继续转录，称为通读，这类引起抗终止作用