蛋白质相互作用研究方法 ▣Pull-down(体外蛋白质相互作用) ▣CO-lP(co-immunoprecipitation,免疫共沉淀) ▣Yeast two-hybrid system(酵母双杂交系统) FRET(fluorescent resonant energy transfer, 光共振能力转移) ▣BlFC(bimolecular flurescent complement,双分 子荧光互补)
蛋白质相互作用研究方法 Pull-down(体外蛋白质相互作用) CO-IP(co-immunoprecipitation,免疫共沉淀) Yeast two-hybrid system(酵母双杂交系统) FRET(fluorescent resonant energy transfer,荧 光共振能力转移) BIFC(bimolecular flurescent complement,双分 子荧光互补)
Pull-down(in vitro） 口原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质 (诱饵蛋白)固定于某种基质上（如 sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可 与该诱饵蛋白发生相互作用的配体蛋白被吸附 通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的 蛋白，并用于下一步检测分析 Bait Prey GST
Pull-down（in vitro） 原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质 （诱饵蛋白）固定于某种基质上（如 sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可 与该诱饵蛋白发生相互作用的配体蛋白被吸附， 通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的 蛋白，并用于下一步检测分析 GST Bait Prey
Pull-down-融合蛋白的表达 tac_promoter M13 pUC fwd_primer M13_puC_rev_primer M13_forward20_prime MscI 465 构建融合表达载体 M13_reverse_primer M13_pUC_rev_primer lac_promoter BstBI 655 GST pGEX 5 prlmer BaTHI 930 5124 loxP AmpR_promoter 大肠杆菌(BL21) EcoRI 1097 46 9ma11104 SalI 1107 转化 XhoI 1112 NotI 1118 lacI Eag11118 V621 pGEX-4T-LP Acceptor oGEX 3 prlmer 3843 1281 5127bp 挑取大肠杆菌 (BL21)表达克隆 AatII 1403 341E 1708 AmpR_promoter 2989 2195 IPTG诱导大肠杆菌 2562 BL21)表达蛋白 Ampicillin pBR322_origin PstI 2080 提取纯化融合蛋白 pGEX-4T-1-GST
Pull-down-融合蛋白的表达 构建融合表达载体 大肠杆菌（BL21） 转化 挑取大肠杆菌 （BL21）表达克隆 IPTG诱导大肠杆菌 （BL21）表达蛋白 提取纯化融合蛋白 pGEX-4T-1-GST
Pul-down实验流程 Step 1.Immobilize the fusion-tagged Step 2.Wash away unbound protein. Step 3.Bind "prey"protein to "bait"from the lysate. immobilized“bait°protein. >BatP酒 Gel Affinity Ligand Co*2 Chelatel P● Bait Protein-Containing Prey Protein-Containing Lysate 2B Spin Step 4.Wash away unbound protein. Step 5.Elute protein:protein interaction Step 6.Analyze protein:protein complex. interaction complex on SDS-PAGE B赋 Prey 828 Mk世 Purifed Agarose Puified 8 G Protein:Pr域n Control Interaction Spin sPM道 Displaced Interacting Complex =Fusicn Tag (GST or polyHis)
Pull-down实验流程
Pul-down的应用 ▣鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作 用 ▣筛选与己知融合蛋白相互作用的未知蛋白 质
Pull-down的应用 鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作 用 筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白 质