(二)分子克隆常用酶 1.限制性内切酶（限制酶)。限制酶能特异性地结合 于一段该酶能识别的特殊DNA序列之上或这一DNA附近的特异 位点上，并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端： (1)粘端。许多限制酶在二重对称轴的5′侧切割底物 DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的粘端的 DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如 下： ↓ 5 NNNNNCTGCAGN NN N N3' 3'NN NNN GA CG T C NNNN N5' 切割后产生两片段： 5'NNNN N CTG C A PG NNNN N3' 3'NNNNN GP A C G T C NNNN N5' 这类限制酶主要有：BamH I、Bgl ll、EcoR I、Hind I川 、KpnI、PstI等等
（二）分子克隆常用酶 1．限制性内切酶（限制酶）。限制酶能特异性地结合 于一段该酶能识别的特殊DNA序列之上或这一DNA附近的特异 位点上，并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端： （1）粘端。许多限制酶在二重对称轴的5′侧切割底物 DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的粘端的 DNA片段。例如，PstI识别双链DNA的这样一段序列并切割如 下： ↓ 5’N N N N N C T G C A G N N N N N3’ 3’N N N N N G A C G T C N N N N N5’ ↑ 切割后产生两片段： 5’N N N N N C T G C A pG N N N N N3’ 3’N N N N N Gp A C G T C N N N N N5’ 这类限制酶主要有：BamH I、BglⅡ、EcoR I、Hind Ⅲ 、Kpn I、Pst I等等
(2)平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA 的两条链，则产生带平端的DNA片段。例如：Hae Ill识别双 链DNA的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5 NNNNNNGGCCNNNNN N3 3'NNNNNNCCGG NNNNN N5 ↑ 切割后产生平端的片段： 5'NNNNNNGG PC C NNNNN N3' 3'NNNNNN C Cp GG NNNNN N5 这类限制酶主要有：Hae川l、MstI、ScaI、SmaI等 等。 目的在于方便地剪贴DNA
（2）平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA 的两条链，则产生带平端的DNA片段。例如：HaeⅢ识别双 链DNA的这样一段序列，并切割如下： ↓ 5’N N N N N N G G C C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C C G G N N N N N N5’ ↑ 切割后产生平端的片段： 5’N N N N N N G G pC C N N N N N N3’ 3’N N N N N N C Cp G G N N N N N N5’ 这类限制酶主要有：HaeⅢ、Mst I、Sca I、Sma I等 等。 目的在于方便地剪贴DNA
2.DNA聚合酶。DNA聚合酶主要用于催化DNA体外合成 反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模 板互补。最常用DNA聚合酶有PCR用的Taq酶、大肠杆菌DNA 聚合酶I（全酶)和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(KIenow片 段)等。 3.连接酶。连接酶用于将两段DNA拼接起来，最常用 的是T4噬菌体连接酶。 4.脱氧核糖核酸酶1。DNA酶I为内切核酸酶。它优先 从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物为5'端带 磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下 ,DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。 5.反转录酶。这类酶可以将RNA作为模板合成互补DNA 链
2．DNA聚合酶。DNA聚合酶主要用于催化DNA 体外合成 反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模 板互补。最常用DNA聚合酶有PCR用的Taq酶、大肠杆菌DNA 聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片 段）等。 3．连接酶。连接酶用于将两段DNA拼接起来，最常用 的是T4噬菌体连接酶。 4．脱氧核糖核酸酶I。DNA酶I为内切核酸酶。它优先 从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA 。产物为5′端带 磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下 ，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。 5．反转录酶。这类酶可以将RNA作为模板合成互补DNA 链
(三)重组载体 有了载体、酶和DNA片段，便可以重组载体。采用某限 制酶切割开载体，用DNA连接酶将载体DNA片段与拟插入的 目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时，插 入片段的平端与载体的平端对接，插入片段的粘端与载体 的粘端对接，两个粘端的序列互补。实现载体重组。然后 转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所 含抗生素抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落 。可以采用原位杂交或扩增阳性单菌落，小量制备DNA,限 制酶酶切鉴定重组成功与否。取成功者用于各有关实验
（三）重组载体 有了载体、酶和DNA片段，便可以重组载体。采用某限 制酶切割开载体，用DNA连接酶将载体DNA片段与拟插入的 目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时，插 入片段的平端与载体的平端对接，插入片段的粘端与载体 的粘端对接，两个粘端的序列互补。实现载体重组。然后 转化特定的大肠杆菌，转化成功的大肠杆菌可以在载体所 含抗生素抗性基因相应的抗生素培养皿中传代，形成菌落 。可以采用原位杂交或扩增阳性单菌落，小量制备DNA，限 制酶酶切鉴定重组成功与否。取成功者用于各有关实验