二.分子生物学的主要技术和方法 (一)载体 载体的使用目的： )重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基 因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插 入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载 体等)，给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、 基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成 为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和 载体重组技术，鉴于PC技术受到酶的性能和方法学等多方 面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难， 所以载体重组技术倍受青睐
二．分子生物学的主要技术和方法 （一）载体 载体的使用目的： 1）重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基 因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插 入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载 体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、 基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成 为中医药实验研究中最为常规的实验。 通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和 载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方 面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难， 所以载体重组技术倍受青睐
2)DDPCR产物的克隆和测序。 3)RACE PCR产物的克隆和测序。 4)构建基因库、CDNA库，等。 5)基因功能检测 6)基因工程（包括基因治疗之类） 1.质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为 3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用 质粒具备了以下几种特性：1)含有多克隆位点区域，可 方便的插入目的DNA片段。2)对细菌的可转移性，即在实 验中，可将质粒诱导入细菌。3)选择标记。常用的有抗 生素抗性基因
2）DDPCR产物的克隆和测序。 3）RACE PCR产物的克隆和测序。 4）构建基因库、cDNA库，等。 5）基因功能检测。 6）基因工程（包括基因治疗之类）。 1．质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为 3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行 复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用 质粒具备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可 方便的插入目的DNA片段。2）对细菌的可转移性，即在实 验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗 生素抗性基因
这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗 生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代， 如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4)在细菌体 内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一 细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子 生物学中应用最为广泛的载体
这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗 生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代， 如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体 内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一 细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子 生物学中应用最为广泛的载体
2.λ噬菌体。入噬菌体的基因组是一组长度约为 5Okb的双链DNA分子。在入噬菌体颗粒内，该DNA为一双 链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链（粘端）。当 λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合 ,形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内 的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA 分子在感染早期充当转录模板。实验用入噬菌体，在其 DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之 用。入噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段， 如有的入噬菌体可插入长达2000Obp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等
2．λ噬菌体。λ噬菌体的基因组是一组长度约为 50kb的双链DNA分子。在λ噬菌体颗粒内，该DNA为一双 链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当 λ噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合 ，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内 的DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA 分子在感染早期充当转录模板。实验用λ噬菌体，在其 DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之 用。λ噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段， 如有的λ噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。 此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等
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左上：质粒载体。左下：λ噬菌体载体。右质粒重组示意图